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      2. 人血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4) ELISA檢測試劑盒說明書

        發(fā)布時間:2024-08-21
        檢測原理
        試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)。往預先包被血管生成素樣蛋白4(angptl4)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、hrp標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并充分洗滌。用底物tmb顯色,tmb在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血管生成素樣蛋白4(angptl4)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(od 值),計算樣品濃度。
        樣品收集、處理及保存方法
        1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
        2. 血漿:edta、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
        3. 細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
        4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
        5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
        自備物品
        1.酶標儀(450nm)
        2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
        3.37℃恒溫箱
        操作注意事項
        1.試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶充分溶解后再使用。
        2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
        3.濃度為0的s0號標準品即可視為陰性對照或者空白,按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍,最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
        4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
        5.所有液體組分使用前充分搖勻。
        試劑盒組成
        名稱
        96孔配置
        48孔配置
        備注
        微孔酶標板
        12孔×8條
        12孔×4條

        標準品
        0.3ml*6管
        0.3ml*6管

        樣本稀釋液
        6ml
        3ml

        檢測抗體-hrp
        10ml
        5ml

        20×洗滌緩沖液
        25ml
        15ml
        按說明書進行稀釋
        底物a
        6ml
        3ml

        底物b
        6ml
        3ml

        終止液
        6ml
        3ml

        封板膜
        2張
        2張

        說明書
        1份
        1份

        自封袋
        1個
        1個

        注:標準品(s0-s5)濃度依次為:0、5、10、20、40、80 mg/l
        試劑的準備
        20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
        洗板方法
        1.手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
        2.自動洗板機:每孔注入洗液350μl,浸泡1min,洗板5次。
        操作步驟
        1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
        2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μl;
        3.待測樣本孔先加樣本10μl,再加樣本稀釋液40μl(即樣本稀釋5倍);空白孔不加。
        4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的檢測抗體100μl,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
        5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
        6.每孔加入底物a、b各50μl,37℃避光孵育15min。
        7.每孔加入終止液50μl,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的od值。
        結(jié)果判斷
        繪制標準曲線:在excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應(yīng)od值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。
        試劑盒性能
        1.準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。
        2.靈敏度:低檢測濃度小于1.0 mg/l。
        3.特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
        4.重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
        5.貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
        6.有效期:6個月
        免責聲明
        1.試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產(chǎn)生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。
        2.嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔。
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