免疫pcr試驗(yàn)方法（一）材料與方法
1.*標(biāo)記特異性抗體的制備免疫球蛋白(如igg、igm)的fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結(jié)合的biotin-hydrazide作*標(biāo)記。
(1) 將純化的抗體(igm或igg， 0.1~1.0ml)在標(biāo)記緩沖液(0.1mol/l naac，ph值5.5， 0.1mol/l nacl)中4℃透析放置一晚。
(2)吸取0.5ml至微量離心管中，加過(guò)酸鈉溶液至終濃度為10mmol/l，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
(3)將氧化的抗體過(guò)pbs平衡的sephadex g25 pd-10預(yù)裝柱，使之與過(guò)酸鈉分開。收集蛋白峰。
(4)向抗體管中加入biotin-lc-hydrazide(pierce)至終濃度5mmol/l，置混搖器上室溫孵育1h。
(5)用含0.02%nan3的pbs平衡sephadex g25預(yù)裝柱，將*標(biāo)記的抗體分子過(guò)柱與游離的*分開。收集蛋白峰，保存-20℃。
2.*標(biāo)記dna片段的制備作為將與抗體偶聯(lián)的報(bào)告dna片段，應(yīng)確保在待測(cè)抗原來(lái)源的機(jī)體dna中無(wú)同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報(bào)告dna去檢測(cè)人源的標(biāo)本。dna片段大小為300~500bp，*標(biāo)記可采用pcr方法，根據(jù)報(bào)告dna的核苷酸序列合成一對(duì)引物，其中一個(gè)引物的5’端堿基上帶有*標(biāo)記。
在0.5mlpcr管中按表將下列試劑混合。
表pcr系統(tǒng)組成
試 劑
添加量
終濃度
10×pcr緩沖液
10.0ul
1×
2.5mm 4dntp混合物
8.0ul
0.2mm
50um*標(biāo)記的上游引物
1.0ul
0.5um
50um*標(biāo)記的下游引物
1.0ul
0.5um
15mm模板dna
1.0ul
1.0ug
taq dna聚合酶
1.0ul
5u
加水至 100ul
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在pcr儀上按下列程序擴(kuò)增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40個(gè)循環(huán)。后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3mol/l kac，250ul無(wú)水乙醇，置-70℃30min。
離心沉淀dna片段，用70%乙醇洗一次。
將沉淀dna干燥后溶于te緩沖液中，保存在-20℃。
3.制備抗體-親和素-dna復(fù)合物將*標(biāo)記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlbsa的pbs中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的*標(biāo)記的dna片段，繼續(xù)孵育30min，后加入10倍分子濃度的*，將親和素分子上的結(jié)合部位飽和。后過(guò)凝膠過(guò)濾柱將復(fù)合物與未結(jié)合的單體分開，加入bsa達(dá)1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
4.免疫pcr
（1） 按常規(guī)elisa方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlpcr管中，4℃放置一晚。
（2） 用pbs洗三次，然后每孔加200ul封閉液（pbs含10mg/ml bsa，1mg/ml魚精dna），室溫孵育30min。
（3） 用tetbs（其配方：20mmol/l edta，0.02%nan3）洗三次。
（4） 將抗體-親和素-dna復(fù)合物稀釋于含有1mg/mlbsa和0.1mg/ml魚精dna的tetbs中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
（5） 用tetbs洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulpcr反應(yīng)液，含有表成分：
試 劑
添加量
終濃度
10×pcr緩沖液
5.0μl
1×
2.5mm 4dntp混合物
4.0μl
0.2mm
50um*標(biāo)記的上游引物
0.5μl
0.5um
50um*標(biāo)記的下游引物
0.5μl
0.5um
15mm模板dna
0.5μl
1.5ug
taq dna聚合酶
0.5μl
2.5u
加水至50μl
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在pcr儀上按下列程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。后72℃延伸10min。
每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結(jié)果，如在pcr時(shí)加入了放射性核素標(biāo)記，則可用x光片顯影。
亦可在凝膠電泳后做southern-blot，用特異性探針雜交，進(jìn)一步提高其特異性和敏感性?！?br>(二)注意事項(xiàng)
本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是獲得適當(dāng)?shù)目贵w-dna復(fù)合物。用鏈親和素將*標(biāo)記的抗體與*標(biāo)記的dna偶聯(lián)的方法，因每個(gè)鏈親和素分子可與四個(gè)*分子結(jié)合，因此要優(yōu)化反應(yīng)條件，以使得每個(gè)鏈親和素分子既能結(jié)合上抗體分子，又能結(jié)合上dna片段。
此外，還可用化學(xué)方法將dna片段與抗體分子共價(jià)偶聯(lián)，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的dna片段分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活，然后通過(guò)自發(fā)的反應(yīng)偶聯(lián)到一起，比如，用n-succinimidyl-s-acetyl thioacetate(sata)活化氨基修飾的dna片段，用sulfo-succinimidyl4-(maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-smcc)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過(guò)加入鹽酸胲（hydroxylamine hydrochloride）使二者偶聯(lián)在一起。
免疫pcr具有高敏感性。因此，抗體和標(biāo)記dna的任何非特異性結(jié)合均可導(dǎo)致嚴(yán)重的本底問(wèn)題。因而在加入抗體和標(biāo)記dna后必須盡可能*地清洗。即使有些特異性結(jié)合的抗體或標(biāo)記dna被洗掉了，亦可在后通過(guò)增加pcr的循環(huán)次數(shù)得到彌補(bǔ)。此外，應(yīng)用有效的封閉劑對(duì)防止非特異性結(jié)合也是非常重要的?？捎妹撝谭酆团Ｑ灏椎鞍鬃龅鞍追忾]劑，用魚精dna做核酸封閉劑。防止本底信號(hào)的另一個(gè)重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測(cè)系統(tǒng)存在的問(wèn)題。即使每一步試驗(yàn)都做得非常認(rèn)真，重復(fù)使用同樣的引物和標(biāo)記dna均會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。
免疫pcr的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記dna序列*是人為選定。因此標(biāo)記dna及其引物可經(jīng)常變換，以避免由于污染造成的假陽(yáng)性信號(hào)。
免疫pcr可以檢測(cè)到常規(guī)免疫學(xué)方法無(wú)法檢測(cè)的樣品。因此，應(yīng)用免疫pcr可在微觀水平（單細(xì)胞）檢測(cè)抗原，定量pcr產(chǎn)物可以估計(jì)某一標(biāo)本中的抗原數(shù)量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時(shí)檢測(cè)到微量的抗原。