1、 菌株
用gs115表達(dá)不出蛋白,換km71h后,大部分克隆能表達(dá)。
2、溫度:
在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)水平可能都不低。
3、ph
手冊上用6.0,ph提高到6.8,不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來。bmmy的ph7.0-7.5比較合適。國內(nèi)外做的的rhsa,zui適ph大概5-6左右。ph3的時候yeast和peptone好像會沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào),具體比例自己去試試。
4、偏愛密碼子
codon bias一般不是主要的問題,你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問題,酵母對分子量大(30kd以上),結(jié)構(gòu)復(fù)雜(如一些蛋白酶),二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá),尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用pichia酵母表達(dá)一個單鏈抗體,29kd,含有2對二硫鍵,表達(dá)量約幾毫克每升,選用酵母偏好密碼子全基因合成后,表達(dá)量沒有什么提高。
5、表達(dá)時間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對照
誘導(dǎo)時間長了以后,是會有很多蛋白分泌出來的,時間越長雜蛋白就越多,且分子量都比較大。做一個空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對照,這樣就會比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。
6、污染
每個樣品從g418板上挑10個左右單克隆于2ml bmgy搖菌(30ml玻璃管,比lb管大一點(diǎn)),紗布一般用8層,一天左右看著比較渾離心,留樣1ml,余1ml換2ml bmmy誘導(dǎo)表達(dá),3,4層紗布足夠了。
污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的,只蓋紗布肯定會污染。加蓋報紙后,就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布,污染的可能當(dāng)然很大,100ml三角瓶,裝量10ml培養(yǎng)液,用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口,空氣浴搖床。
7、不表達(dá)
蛋白有沒有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了,一般重復(fù)2-3次實驗都沒有表達(dá)菌株,這個蛋白就放棄表達(dá)了。
8、表達(dá)量
30kd,10mg/l表達(dá)量已經(jīng)很高,zui直接的方法是發(fā)酵,一般提高5-10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。
9、糖基化
酵母分泌表達(dá)的n糖基化是可以預(yù)測的,有如下序列:n x s/t就是潛在的糖基化位點(diǎn),x為任意氨基酸,1個糖基化位點(diǎn)會加上1-3kd左右的糖基。另外可能還有o糖基化話,但是無法預(yù)測其位點(diǎn),不過很少聽說表達(dá)蛋白有o糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá),不存在糖基化的問題。
10、表型與表達(dá)
重組sali和bglii酶切產(chǎn)生單交換和雙交換,結(jié)果就是產(chǎn)生mut+和muts表型的菌株;前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時生長快,消耗的甲醇多,后者生長慢,消耗的甲醇少,所以誘導(dǎo)表達(dá)時muts表型要求更高的菌體濃度。一般用mut+表型的較多,但是對某些蛋白muts菌株可能表達(dá)的更好,只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。
11、培養(yǎng)基
ypd:zui基本的培養(yǎng)用;bmgy:誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用;bmmy:誘導(dǎo)表達(dá)用;md:電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。
yepd是不能代替bmgy的,因為有葡萄糖,這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過有一種方法是可行的,就是用ypg培養(yǎng)基代替,只是把yepd中的葡萄糖用3%的甘油代替,也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比,甘油殘余會抑制甲醇利用。
bmgy、bmmy滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、*。配制bmmy時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇,在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。
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