交直流漏電起痕試驗(yàn)機(jī)微機(jī)控制電子拉力機(jī)壓縮試驗(yàn)機(jī)拉力機(jī)聚合酶鏈反應(yīng)
pcr-sscp分析的基本程序?yàn)椋菏紫萷cr擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，dna單鏈的遷移率除與dna鏈的長(zhǎng)短有關(guān)外，更主要的是取決于dna單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，dna單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由dna單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長(zhǎng)度的dna單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。pcr產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶dna中含單堿基置換，或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異dna與正常dna區(qū)分開。由此可見，pcr-sscp分析技術(shù)是一種dna單鏈凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長(zhǎng)dna單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測(cè)基因變異。該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測(cè)、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領(lǐng)域。為了高靈敏特異性地顯示sscp分析結(jié)果，現(xiàn)已發(fā)展多種pcr-sscp技術(shù)，各有其優(yōu)勢(shì)及適用領(lǐng)域。例如，可以在pcr擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹的放射性同位素pcr-sscp法。在進(jìn)行pcr擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)，利用γ-32p-atp標(biāo)記引物或直接在pcr反應(yīng)體系中加入α-32p-dctp進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使pcr擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測(cè)和篩選；后者操作簡(jiǎn)便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開展，可用于小樣本或大樣本的檢測(cè)和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。一、試劑準(zhǔn)備⒈ pcr相關(guān)試劑⒉ α-32p-dctp⒊ 30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddh2o中，4 oc保存。⒋ 10％過胺配制方法：1g 過胺，溶于10ml ddh2o中，4 oc保存（可用數(shù)周）。⒌ temed（n，n，n，n’，n’-四甲基乙二胺）⒍ 5×tbe緩沖液：tris堿54g、硼酸27.5g、0.5m edta(ph 8.0) 20ml，加ddh2o至1000ml。7．變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mm edta(ph 8.0)二、操作步驟⒈ pcr擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10μl，在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分：10×buffer 1μldntpmix 70μmdna模板 100ng引物及taq dna酶 依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入α-32p-dctp 0.1μl加ddh2o至 10μl
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