htert成纖維細(xì)胞為永生化子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞 (t hesc) 具有延長(zhǎng)的壽命，并且在核型、形態(tài)和表型方面與原代親代細(xì)胞相似。在功能上，t hescs 顯示激素治療后蛻膜化的生化終點(diǎn)。
thescs來(lái)源于從患有肌瘤的成年女性身上獲得的基質(zhì)細(xì)胞。原代基質(zhì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞通過(guò)用來(lái)自包裝細(xì)胞系pa317-htert的上清液感染而永生化，該細(xì)胞系表達(dá)htert和嘌呤霉素抗性基因。
htert成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方案如下：
一、所需材料
dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem)/f12 (sigma, d2906)
碳酸氫鈉
its+ universal culture supplement premix (bd, 354352)
嘌呤霉素
木炭/葡聚糖處理的胎牛血清（hyclone，sh30068.03）
胰蛋白酶-edta溶液（hbss中的0.25%胰蛋白酶/0.53 mm edta）
細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的dmso
實(shí)驗(yàn)耗材：t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、nest錐形瓶、移液槍吸頭等
實(shí)驗(yàn)室儀器：-80冰箱、知楚二氧化碳振蕩搖床、恒溫水浴鍋、瑞寧移液器、液氮罐、倒置顯微鏡等
二、培養(yǎng)基的制備
這些細(xì)胞系的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是dmem/f12，輔以：
1.5克/升碳酸氫鈉
1% its+ universal culture supplement premix
500納克/毫升嘌呤霉素
10%木炭/葡聚糖處理的胎牛血清
三、冷凍細(xì)胞的處理程序和培養(yǎng)的啟動(dòng)
為確保高活力，解凍小瓶并在收到后盡快開(kāi)始培養(yǎng)。如果到達(dá)后需要儲(chǔ)存冷凍培養(yǎng)物，請(qǐng)將小瓶?jī)?chǔ)存在液氮蒸氣中，而不是-70°c。在-70°c下儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致活性喪失。
有關(guān)從每批atcc子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞中回收的活細(xì)胞總數(shù)，請(qǐng)參閱產(chǎn)品信息表最后一頁(yè)上提供的批次特定信息。
準(zhǔn)備一個(gè)含有推薦的培養(yǎng)基的25 cm2或75 cm2培養(yǎng)瓶。在添加小瓶?jī)?nèi)容物之前，應(yīng)將含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的容器置于培養(yǎng)箱中至少15分鐘，以使培養(yǎng)基達(dá)到其正常ph值（7.0至7.6），并避免在恢復(fù)過(guò)程中培養(yǎng)基堿度過(guò)高的細(xì)胞。
在37°c水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。為減少污染的可能性，請(qǐng)將o形圈和蓋子遠(yuǎn)離水。解凍應(yīng)該很快（大約2分鐘）。
1.細(xì)胞解凍后，請(qǐng)盡快從水浴鍋中取出，并使用70%乙醇溶液來(lái)進(jìn)行凈化。操作過(guò)程需要在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，避免污染。
2.將小瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有6.0至8.0 ml培養(yǎng)基的離心管中，并以大約125 xg的速度將細(xì)胞懸浮液離心5至7分鐘。
3.丟棄上清液并將細(xì)胞重新懸浮在新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（有關(guān)推薦的稀釋比，請(qǐng)參閱特定于批次的信息）。將此懸浮液添加到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中。
4.在37°c、5% co2加濕培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)物。
四、繼代培養(yǎng)程序
使用nest的t75錐形瓶進(jìn)行培養(yǎng)的體積。增加或減少其他尺寸的培養(yǎng)容器所需的解離介質(zhì)的量。
htert成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
為避免結(jié)塊，在等待細(xì)胞分離時(shí)不要敲打或搖動(dòng)燒瓶。難以分離的細(xì)胞可置于37°c以促進(jìn)分散。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要每2到3天更新一次培養(yǎng)基。
1.有關(guān)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的濃度，請(qǐng)參閱產(chǎn)品信息表。當(dāng)確定細(xì)胞已準(zhǔn)備好進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，繼續(xù)下一步。
2.取出并丟棄介質(zhì)。
3.向燒瓶中加入2.0至3.0 ml trypsin-edta溶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，直至細(xì)胞層分散（通常在5至15分鐘內(nèi)）。
4.添加6.0至8.0 ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并通過(guò)輕輕移液吸出細(xì)胞。
5.將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，并以大約125 xg的速度旋轉(zhuǎn)5至10分鐘。
6.丟棄上清液并在新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。將適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液等分試樣添加到新的細(xì)胞搖瓶中。
7.有關(guān)推薦的接種濃度，請(qǐng)參閱產(chǎn)品表。
五、細(xì)胞凍存
在以下培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞：95%生長(zhǎng)培養(yǎng)基，5% dmso。將小瓶?jī)?chǔ)存在液氮蒸氣中。避免將小瓶浸入液氮中。
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