mtt法又稱mtt比色法,是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
常用實(shí)驗(yàn)步驟:
1.接種細(xì)胞:用含10%胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔合適的細(xì)胞數(shù)量接種到96孔板,每孔體積180ul;
2.培養(yǎng)細(xì)胞:同一般培養(yǎng)條件,可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間;
3.呈色:每孔加mtt溶液(5 mg/ml用pbs緩沖液ph=7.4配制)20ul。繼續(xù)孵育4小時(shí),終止培養(yǎng),小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,對(duì)于懸浮細(xì)胞,需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150uldmso,振蕩10分鐘,使結(jié)晶物充分融解。
影響實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵因素:
1. 細(xì)胞消化。若消化出現(xiàn)問(wèn)題,則會(huì)影響細(xì)胞的活性,進(jìn)而影響od值。對(duì)于 mda-mb-231、mcf-7、hs-578t 等一系列容易消化的細(xì)胞,消化時(shí)*中不添加edta,消化時(shí)也僅需*浸潤(rùn)數(shù)秒即可。然而,對(duì)于sw480等一系列難以消化的細(xì)胞,*中需添加濃度為0.25%的edta;
2. 接種數(shù)量。對(duì)于細(xì)胞接種數(shù)量要適宜,過(guò)小或過(guò)大均會(huì)影響od值(過(guò)小細(xì)胞容易死亡,過(guò)大細(xì)胞容易生長(zhǎng)擁擠);
3. 培養(yǎng)液的棄去?;蛴靡埔浩魑】變?nèi)培養(yǎng)液,吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取,不要觸碰底部的紫色結(jié)晶?;?qū)?6孔板倒扣于濾紙上來(lái)吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。
4. 結(jié)晶物的溶解。加入dmso,放入37℃孵箱內(nèi)孵育10~20 min,有助于dmso對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解。
困惑:
棄液,細(xì)胞脫落或培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶易吸去,重復(fù)性差,怎么辦?
建議先用平板離心機(jī)離心96孔板,之后參考以下*方法:方法1:用1ml醫(yī)用的注射器加上針頭吸取液體,吸取時(shí)要把板子斜放,沿著壁吸取。
方法2:優(yōu)化操作,使用三聯(lián)溶解液:10%sds,5%異丁醇,0.012 mol/lhcl,蒸餾水溶解。
文獻(xiàn):評(píng)價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良mtt方法.周建軍.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1993,24(10):455-457.
方法3:使用mtsblue。mtsblue的活性成份是resazurin,一種無(wú)毒、可透膜的藍(lán)色染料,有微弱的熒光性。聯(lián)科生物mtsblue采用單一試劑,只需加入培養(yǎng)基即可連續(xù)、快速地檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況。相比于mtt,無(wú)毒、即用、可連續(xù)檢測(cè),值得*。
方法4:使用cck-8試劑,它利用有高度水溶性的黃色甲染料,且cck-8試劑組分單一,無(wú)需其它組分預(yù)混等操作。相比mtt,cck-8:
1、操作簡(jiǎn)便,只需一步即可得到結(jié)果;
2、省時(shí)即開即用,無(wú)需配置其它溶液;
3、安全,無(wú)需放射性同位素和有機(jī)溶劑;
4、快速,省去了溶解沉淀等操作;
5、重現(xiàn)性好,步驟少、損失少。
mtsblue檢測(cè)bhk21 細(xì)胞:
聯(lián)科生物提供不同規(guī)格mtt、mtsblue 、cck8試劑供實(shí)驗(yàn)選擇。有需求的同學(xué),請(qǐng)聯(lián)系聯(lián)科生物當(dāng)?shù)劁N售。
產(chǎn)品列表:
存貨編碼 存貨名稱 規(guī)格型號(hào) 目錄價(jià)
70-mtt001 mtt細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 100assays 150
70-mtt002 mtt細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 200assays 200
70-mtt005 mtt細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 500assays 300
70-mtt010 mtt細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 1000assays 500
70-cc0601 mtsblue cell viability reagent 100 t 90
70-cc0602 mtsblue cell viability reagent 500 t 300
70-cc0603 mtsblue cell viability reagent 1000 t 600
70-cc0604 mtsblue cell viability reagent 10000 t 2000
70-cck801 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 100t 200
70-cck802 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 200t 360
70-cck805 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 500t 600
70-cck810 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 1000t 1000
70-cck830 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 3000t 2400
70-cck8100 cell counting kit-8(cck-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒) 10000t 6000