大鼠ⅳ型膠原(col4）elisa試劑盒操作指導
大鼠ⅳ型膠原(col4）elisa試劑盒實驗原理
大鼠ⅳ型膠原(col4）elisa試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）。往預先包被大鼠ⅳ型膠原(col4）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、hrp標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物tmb顯色，tmb在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠ⅳ型膠原(col4）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（od 值），計算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
需要而未提供的試劑盒器材
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標板
8孔×12條
8孔×6條
無
標準品
0.3ml*6管
0.3ml*6管
無
樣本稀釋液
6ml
3ml
無
檢測抗體-hrp
10ml
5ml
無
20×洗滌緩沖液
25ml
15ml
按說明書進行稀釋
底物a
6ml
3ml
無
底物b
6ml
3ml
無
終止液
6ml
3ml
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
備注：
1、標準品濃度依次為：詳見說明書；
2、經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μl樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。
注意事項
1、嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2、洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3、消除板底殘留的液體和手指印，否則影響od值。
4、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5、避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9、不能使用過期產(chǎn)品。
10、如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl；
3.樣本孔中加入待測樣本50μl；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（hrp）標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μl），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的od值。
實驗結(jié)果計算
以所測標準品的od值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的od值代入方程，計算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1、檢測范圍：詳見產(chǎn)品說明書。
2、靈敏度：最di檢測濃度小于0.1u/l。
3、特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
4、重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于15%。