高效液相色譜法是20世紀(jì)70年代急劇發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效、快速的分離、分析技術(shù)。液相色譜法是指流動(dòng)相為液相的色譜技術(shù)，在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上，引入氣相色譜法理論，在技術(shù)上采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分析效率高和操作自動(dòng)化，它具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點(diǎn)。
它是用高壓將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。
高效色譜柱是高效液相色譜的心臟，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性，延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。
色譜柱使用一段時(shí)間后***會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化，如不采取措施，將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命，影響工作效率，并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有必要加強(qiáng)和規(guī)范色譜柱的管理，從而延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。本文從影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素出發(fā)，從管理的角度，探討色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)。
1 色譜柱的類型
常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹(shù)脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十八烷基硅烷鍵合硅膠***常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來(lái)，由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展，離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應(yīng)用也越來(lái)越廣。
2 影響色譜柱使用壽命的因素
2.1 流動(dòng)相
在以水溶液為流動(dòng)相時(shí)，水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長(zhǎng)，當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí)，一些霉菌可能在色譜柱中滋生，堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問(wèn)世，目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um，流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的ph值對(duì)色譜柱也有影響，特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料，水溶液的ph***適范圍在2~7.5之間，當(dāng)ph>8時(shí)，硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子，且難以復(fù)原，柱效很快降低，甚至******失效。
當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí)，鹽類的溶解度下降，會(huì)析出鹽沉淀，堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板，產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響，對(duì)于硅膠柱，甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料；反之，對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠，極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽(yáng)離子交換樹(shù)脂色譜柱，而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹(shù)脂柱。
2.2 樣品和固定相
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中，在通過(guò)固定相會(huì)堵塞柱子，樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過(guò)柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸附，這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng)，尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重。因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫(schiff)縮合而減少活性點(diǎn)，使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵(si-o-si)連接在硅基質(zhì)上，形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相si-o-si-r(r為cnh2n+1)，硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂，使鍵合基團(tuán)脫落。
3 高效液相色譜柱的管理
3.1 色譜柱的管理
制定色譜柱管理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。每一根新購(gòu)進(jìn)的色譜柱必須造冊(cè)登記，內(nèi)容包括：生產(chǎn)公司、品名、型號(hào)、規(guī)格、購(gòu)進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內(nèi)保護(hù)溶液等。色譜柱分類存放，硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹(shù)脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒，盒上貼上標(biāo)簽，注明類別，隨柱說(shuō)明書(shū)裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱，在色譜柱上貼上標(biāo)簽，注明啟用日期。
每根柱子每?jī)蓚€(gè)月保養(yǎng)一次，特別是對(duì)于一些使用頻率少的柱子，因?yàn)榉胖脮r(shí)間長(zhǎng)，容易干柱，每一次做好保養(yǎng)記錄。對(duì)于確已失效的柱子，做好停用記錄，不能隨意丟棄，專門(mén)存放，如果現(xiàn)用的柱子的填料需要，可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門(mén)，對(duì)于使用時(shí)間較長(zhǎng)柱效降低的柱子，可把它用于檢測(cè)產(chǎn)品的中間體。
3.2 色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱使用一段時(shí)間后，常遇到柱子被污染，柱效會(huì)有一定程度的下降，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù)，可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
樣品和流動(dòng)相的處理：溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過(guò)濾以除去不溶物。如果必要，需進(jìn)行樣品的預(yù)處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響柱效，所以溶劑盡量使用色譜級(jí)別的，至少是分析純級(jí)別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過(guò)濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過(guò)濾器，過(guò)濾器定期用甲醇超聲清洗，如果效果不好，可用10%的稀硝酸浸泡清洗。對(duì)于堵塞嚴(yán)重的過(guò)濾器，可在火焰上灼燒后再清洗。
保護(hù)柱(預(yù)柱)的使用：對(duì)于較昂貴的色譜柱，可以在柱前加一保護(hù)柱，防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱，對(duì)于制備柱，因其進(jìn)樣量大，使用保護(hù)柱尤為重要。
常規(guī)處理：硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長(zhǎng)時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗。鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗，再用甲醇沖洗，然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過(guò)夜。
對(duì)于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生：再生處理包括活化(右→左)和凈化(左→右)兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗：******基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱：蒸餾水←→甲醇(沖洗過(guò)程中可加入少量二甲基甲酰胺)。離子交換樹(shù)脂柱：高濃度的nacl溶液(1-2moll的nacl溶液)可使大部分樹(shù)脂再生，油脂等少數(shù)與樹(shù)脂緊密結(jié)合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液(如0.1moll的naoh溶液)沖洗，酸性有機(jī)物吸附在固定相的用低ph緩沖液沖洗，堿性有機(jī)物用高ph緩沖液沖洗，然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
凝膠色譜柱：由于凝膠色譜柱是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì)，通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑(0.2%-1%np-40或lubrol)沖洗可除去大部分的結(jié)合物質(zhì)，如果一些污染物仍然不能清除時(shí)，用24%或30%乙腈沖洗過(guò)夜可除去疏水蛋白，用30%-50%乙酸可除去親水蛋白，用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量，然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
已污染的色譜柱的處理：因保留強(qiáng)的物質(zhì)污染，流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭，可用下列方法洗滌：去除脂類可用四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌；去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三進(jìn)行梯度洗脫；一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫，同時(shí)反復(fù)注入100-200ml的四氫呋喃。
柱頭處理：對(duì)于柱頭堵塞污染嚴(yán)重的情況而且用溶劑沖洗無(wú)效的色譜柱，只有打開(kāi)柱子去除柱頂?shù)奶盍现匮b：先拆下不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器，檢查柱床，常見(jiàn)凹陷或受污染的帶色填料，剔去不規(guī)則床層和帶色填料，使柱床顯白色并******水平，再用甲醇作糊狀填料勻漿液，將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液，重復(fù)直到填料水平。
柱子的貯存：首先柱子必須清洗干凈后才能貯存，柱子不能貯存在水或水性溶劑中，否則會(huì)引起微生物的滋生。極性色譜柱可用適當(dāng)溶劑如二氯甲烷沖洗；鍵合相色譜柱用甲醇沖洗；陰離子交換色譜柱用0.002%洗必泰(雙氯苯雙胍己烷)的緩沖液沖洗；陽(yáng)離子交換色譜柱用0.005%硫柳汞緩沖液沖洗；凝膠色譜柱用緩沖液中加0.02%或用20%乙醇沖洗。再將柱子兩頭密封，以防止溶劑蒸發(fā)使柱子干燥而引起柱子結(jié)構(gòu)的幾何學(xué)改變。