對于做過分子實驗的小伙伴來說，傳統(tǒng)的分子克隆技術——酶切連接，大家應該都是比較熟悉的，那么對于其他的分子克隆技術類型大家有了解過嗎？根據不同的實驗需求，來選擇不同的分子克隆技術以及產品。本期，小愛帶大家一起來了解下幾種常規(guī)的分子克隆技術吧。
一、酶切連接
酶切連接法屬于經典的分子克隆方法，利用限制性內切酶切割dna和利用dna連接酶連接dna，最后轉化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。
圖1 酶切連接流程
成功的酶切和有效的連接是分子克隆實驗圓滿完成的必要條件。限制性內切酶能特異性地結合于能被限制性內切酶識別的dna序列之內或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈dna。根據限制酶的識別切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可分為ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型。分子克隆技術中常用的是ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性dna。
粘性末端，即限制性內切酶在dna雙鏈上交錯切割，形成的核苷酸順序互補的，可形成氫鍵的末端（見圖2）。
平齊末端，限制性內切酶在dna雙鏈的相同位置切割dna分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的dna片斷（見圖3）。
圖2 ecor i切割dna形成粘性末端dna片段
圖3 alui切割dna形成平末端dna片段
absin擁有目前常用的幾種限制性內切酶，包括快速內切酶bsai(abs60206)、快速內切酶clai(abs60209)、快速內切酶ecori(abs60213)、快速內切酶hindiii(abs60217)等四十多種。
absin限制性內切酶產品特點：
1、快速酶切：5-15min即可完成酶切；
2、通用的buffer：大大簡化了酶切反應；
3、高保真：極低的星號活性；
4、高度冗余：輕松應對過量、復雜底物；
5、良好的兼容：經驗證所有absin快速內切酶與其他品牌酶切體系相互兼容。
表1 absin限制性內切酶介紹
貨號
產品名稱
規(guī)格
abs60200
快速內切酶apali
200t
abs60201
快速內切酶asci
50t
abs60202
快速內切酶avrii
25t
abs60203
快速內切酶bamhi
500t
abs60204
快速內切酶bcli
125t
abs60205
快速內切酶bglii
100t
abs60206
快速內切酶bsai
50t
abs60207
快速內切酶bstbi
100t
abs60208
快速內切酶bsteii
100t
abs60209
快速內切酶clai
50t
abs60210
快速內切酶dpni
50t
abs60211
快速內切酶dpnii
50t
abs60212
快速內切酶eagi
25t
abs60213
快速內切酶ecori
600t
abs60214
快速內切酶ecorv
200t
abs60215
快速內切酶esp3i(bsmbi)
30t
abs60216
快速內切酶fspi
50t
abs60217
快速內切酶hindiii
500t
abs60218
快速內切酶hinfi
500t
abs60219
快速內切酶hpai
50t
abs60220
快速內切酶kpni
200t
abs60221
快速內切酶mlui
100t
abs60222
快速內切酶mnli
50t
abs60223
快速內切酶ncoi
30t
abs60224
快速內切酶ndei
200t
abs60225
快速內切酶nhei
30t
abs60226
快速內切酶noti
50t
abs60227
快速內切酶nrui
50t
abs60228
快速內切酶nsii
25t
abs60229
快速內切酶paci
25t
abs60230
快速內切酶psti
500t
abs60231
快速內切酶pvuii
200t
abs60232
快速內切酶saci
100t
abs60233
快速內切酶sacii
50t
abs60234
快速內切酶sali
200t
abs60235
快速內切酶sbfi
25t
abs60236
快速內切酶smai
100t
abs60237
快速內切酶spei
50t
abs60238
快速內切酶sphi
50t
abs60239
快速內切酶sspi
60t
abs60240
快速內切酶stui
100t
abs60241
快速內切酶taqi
200t
abs60242
快速內切酶xbai
500t
abs60243
快速內切酶xhoi
500t
abs60244
內切酶sgei
250u
核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。dna接酶催化雙鏈dna子中相鄰堿基的5’-p末端與3-0h間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的dna連接酶是t4 dna連接酶——t4 dna ligase(abs60084)，被稱為生物界的“502”。在有mg2+和atp存在的條件下，t4 dna ligase能催化雙鏈dna或rna上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈dna的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復雙鏈dna、rna或dna/rna雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈dna之間的連接。
圖4 t4 dna連接酶作用位點
二、ta克隆
ta克隆是指把pcr片段與一個具有3‘-t突出的載體dna連接起來的方法?？捎糜诓磺宄康幕虻膁na序列，獲得的目的片段通常需要通過ta克隆的方法重組到t-載體中，通過測序測定dna序列。absin t-vector快速克隆試劑盒(abs60085)是高效、便利的pcr產物克隆專用試劑盒。
absin t-vector快速克隆試劑盒(abs60085)產品特點：
1、陽性率高：高純度酶切型線性t載體，連接效率更高，藍斑率低于10% ；
2、方便快捷：預混連接反應體系，最快5分鐘實現連接，無需純化，直接轉化；
3、t simple載體無常用酶切位點，利于含酶切位點基因克??；
4、無ndei或ncoi位點，便于重組表達基因的克?。?br>5、提供純化的pcr片段作為陽性質控對照；
6、藍白篩選：高表達活性的β-半乳糖苷酶，顯色更快更深；
7、批次穩(wěn)定：遵循標準化生產流程，經過嚴格的質量檢測。
圖5 ta克隆流程
三、無縫克隆
無縫克隆技術是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標dna的片斷的插入，而不需要任何限制性內切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。absin快速多片段dna組裝預混液(abs60250)就是基于重組原理的無縫克隆技術，它不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據dna片段與線性化載體末端的15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的dna定向克隆技術。
absin快速多片段dna組裝預混液(abs60250)特點：
1、簡單便捷：兼容pcr產物體系與載體酶切體系，省去繁瑣的純化步驟；
2、高陽性率：定向克隆單個dna片段至載體上，陽性率高于95%；
3、快速反應：反應時間大大縮短，最快僅需5min；
4、單/多片段均可連接：單個或多個片段同時插入，省去重復純化與酶切過程。
圖6 absin快速多片段dna組裝預混液(abs60250)無縫克隆操作流程
四、topo克隆
topo克隆實際是基于拓撲異構酶的克隆技術，關鍵是拓撲異構酶。該技術不需要限制性內切酶或外源連接酶，從而提供了將新的pcr產物克隆到質粒中的極其簡便快捷的方法。
topo克隆產品特點：快捷，不需連接酶，克隆三步到位。
表2 愛必信topo克隆產品
貨號
產品名稱
規(guī)格
abs60091
t-vector ptopo快速克隆試劑盒
20t/100t
abs60094
blunt ptopo快速克隆試劑盒
20t/100t
abs60095
pbm16a toposmart快速克隆試劑盒
20t/3×20t
abs60096
pbm27 toposmart快速克隆試劑盒
20t/3×20t
五、geteway克隆
geteway克隆利用位點特異重組實現目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會替換成目的片段，不依賴限制性內切酶和連接酶，導入目的基因不需要開環(huán)處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個載體，快速、高效將dna序列轉移到載體上的克隆。
absin特色產品線：
wb相關：ecl發(fā)光液、預染marker、預制膠；ihc相關：二抗試劑盒、組化筆；ip/coip試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；elisa試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...