在透射光顯微鏡，標(biāo)本質(zhì)量并不總是借給自己容易觀察和圖像記錄在簡(jiǎn)單明成像模式出色的對(duì)比度。 處理固有的低對(duì)比度的標(biāo)本，如細(xì)菌不染，超薄組織切片，貼壁活細(xì)胞的研究，依靠專(zhuān)門(mén)的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，以協(xié)助這些成像幾乎透明的樣品。 在通過(guò)在樣品和背景之間的亮度分布差異非常小的變化樣品檢驗(yàn)結(jié)果未染色標(biāo)本，光吸收差的過(guò)程。 當(dāng)背景是明亮的，人眼需要至少10至20%的局部強(qiáng)度的波動(dòng)，以便能夠識(shí)別標(biāo)本的信息。 不幸的是，這種電平調(diào)制的很少見(jiàn)到有透明的標(biāo)本，其通常呈現(xiàn)幾乎看不見(jiàn)針對(duì)類(lèi)似強(qiáng)度的背景。 術(shù)語(yǔ)透射光 ，在光學(xué)顯微鏡中使用時(shí)，是指其中光從照明源傳遞試樣的相反側(cè)的物鏡(因此，照明是通過(guò)樣品傳送的 )的任何成像模態(tài)。 在本節(jié)描述的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)代表了多種樣品制備方法，以及產(chǎn)生這對(duì)于觀察和成像有用強(qiáng)度的變化的光學(xué)技巧。
方法能夠增強(qiáng)對(duì)比度包括微分干涉對(duì)比（dic），偏振光，相位相反，霍夫曼調(diào)制對(duì)比，以及暗場(chǎng)顯微鏡(實(shí)施例在圖1中示出)。 幾個(gè)這些技術(shù)是由光原產(chǎn)于成像較厚植物和動(dòng)物組織，當(dāng)從焦平面去除區(qū)域的限制，而偏振光需要雙折射率(通常不存在于動(dòng)物細(xì)胞中一個(gè)顯著度)以產(chǎn)生對(duì)比。
圖1所示是各種被在透射光顯微鏡通常使用流行的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)。 圖1中的薄的*分(一)揭示了用曙紅和蘇木精以產(chǎn)生明場(chǎng)成像模式下的色彩對(duì)比度的人基底細(xì)胞癌。 圖1(b)表示活hela細(xì)胞與相襯成像的塑料的組織培養(yǎng)容器中。 安裝在水性介質(zhì)中的中國(guó)麂細(xì)胞的固定培養(yǎng)都在圖1的(c)微分干涉對(duì)比圖像呈現(xiàn)。 在食鹽水溶液沐浴小鼠心臟肌肉的新鮮組織切片顯示在圖1(d)面板，其中使用霍夫曼調(diào)制(或zeiss varel)相反，斜光技術(shù)產(chǎn)生的對(duì)比度。 與暗場(chǎng)照明觀察輝煌明亮式暗對(duì)比度使用obelia水螅標(biāo)本圖1(e)所示。 后，兔骨骼肌纖維(圖1(f))是生物樣本是雙折射的，并且表現(xiàn)出在偏振光對(duì)比度之間。
明場(chǎng)照明
其中的所有形式的光學(xué)顯微鏡用于過(guò)去三個(gè)世紀(jì)的首要和喜歡的技術(shù)，明照明依賴于光的吸收，折射率，或顏色變化產(chǎn)生的反差。 作為光穿過(guò)樣品，即改變區(qū)域的方向，速度和/或波前的光譜產(chǎn)生時(shí)的光線被聚集和由物鏡聚焦的光的差距(對(duì)比度)。 在明場(chǎng)系統(tǒng)分辨率取決于物鏡和聚光鏡數(shù)值孔徑，和一個(gè)浸沒(méi)介質(zhì)上需要的試樣(對(duì)數(shù)值孔徑的組合超過(guò)2.3的值)的兩側(cè)。 數(shù)碼相機(jī)提供的寬動(dòng)態(tài)范圍和捕獲存在于明場(chǎng)圖象中的信息所需的空間分辨率。 另外，背景減除算法，使用平均以在光路中無(wú)試樣采取幀，顯著地增加對(duì)比度。
簡(jiǎn)單明成像，以適當(dāng)調(diào)整對(duì)柯勒照明顯微鏡，提供的關(guān)于細(xì)胞輪廓，核的位置，并在未染色標(biāo)本較大囊泡的位置信息的程度有限。 對(duì)比在明成像取決于光的吸收，折射率或色差。 作為光通過(guò)試樣改變方向，速度或成像波前的光譜特性的光的差距(對(duì)比度)的開(kāi)發(fā)。 該技術(shù)是用可見(jiàn)光吸收染料染色的標(biāo)本更為有用(如曙紅和蘇木;參見(jiàn)圖1(a))。 然而，普遍缺乏檢查未染色標(biāo)本時(shí)，在明模式的對(duì)比度使得這種技術(shù)相對(duì)無(wú)用的活細(xì)胞結(jié)構(gòu)的認(rèn)真調(diào)查。
相差
首先由荷蘭人弗里茨·澤爾尼克在1934年描述，相襯贏得了發(fā)現(xiàn)者的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)于1953年，而在活細(xì)胞革命性基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。 該技術(shù)是理想的薄未染色標(biāo)本(如玻璃上培養(yǎng)的細(xì)胞)，這是大約為5至10微米厚的核以上，但低于在外圍厚微米。 這樣試樣幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出任何的光吸收在光譜的可見(jiàn)部分和在明場(chǎng)和暗場(chǎng)照明人眼不能檢測(cè)到它們。 相襯(如在圖1(b)所示)采用一個(gè)光學(xué)機(jī)構(gòu)在相轉(zhuǎn)化的微小變化成振幅相應(yīng)的變化，這可以看作在圖像對(duì)比度的差別。 顯微鏡必須配備含有環(huán)形或匹配于一組含有相環(huán)(設(shè)計(jì)ph）中的后側(cè)焦點(diǎn)面物鏡的一系列的環(huán)的一個(gè)專(zhuān)門(mén)聚光鏡(相差物鏡也可以與熒光使用，但有輕微的減少傳輸)。 相襯是觀察或培養(yǎng)成像活細(xì)胞時(shí)，增加對(duì)比度的好方法，但通常會(huì)導(dǎo)致周?chē)倪吘壧卣鞯妮喞獣灐?這些光環(huán)是光的文物，往往減少的邊界細(xì)節(jié)的可見(jiàn)度。 該技術(shù)是沒(méi)有用的厚標(biāo)本(如植物和動(dòng)物組織切片)，因?yàn)橄嘁瓢l(fā)生扭曲圖像細(xì)節(jié)的焦平面刪除的區(qū)域。 此外，漂浮物和其他外的焦點(diǎn)相對(duì)象與蓋玻片成像粘附細(xì)胞干擾。
如圖2中所示，細(xì)胞的折射率和其周?chē)乃芤褐g和細(xì)胞質(zhì)(圖2(b))和細(xì)胞核(圖2(c))的之間的細(xì)胞內(nèi)的存在非常小的差異。 無(wú)顯著折射率差發(fā)生在蓋玻片和周?chē)橘|(zhì)(圖2(a))。 相襯使得這些微小差異通過(guò)使用光學(xué)操縱，例如，它它們翻譯成可被目視觀察并記錄在強(qiáng)度差可見(jiàn)。 在這種情況下，所用的光學(xué)效應(yīng)包括光的波前通過(guò)試樣的不同部分行進(jìn)之間的相位關(guān)系的轉(zhuǎn)變。 期間通過(guò)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)，或水的旅途中，光波通過(guò)小度錯(cuò)開(kāi)(延遲)，因?yàn)檫@些媒體具有稍微不同的折射率(的介質(zhì)的折射率越高，較小的速度或光速在培養(yǎng)基中)。 其結(jié)果，已通過(guò)一個(gè)細(xì)胞核傳遞光波滯后于光波只有通過(guò)水的后面(比較圖2(a)和圖2的(c))。 滯后的量被稱(chēng)為相移。 其進(jìn)入檢體之前，海浪仍在相(蓋玻片下方波前)，但是這是不再時(shí)，他們已通過(guò)具有不同折射率的各種材料傳遞的情況。 相移的量取決于波都通過(guò)它們的路徑通過(guò)什么媒體(折射率)，并且路徑是通過(guò)這些媒體多久。 人眼不能看到的顯微鏡圖像，這些相移，它僅能夠不同的強(qiáng)度和顏色來(lái)區(qū)分。 因此，相襯技術(shù)使用光學(xué)技巧來(lái)轉(zhuǎn)化相移為灰度值。
在相差顯微鏡構(gòu)造中，聚光鏡孔徑光闌被照亮通過(guò)在光方式的中空錐體聚光鏡光學(xué)部件的檢體的相位停止(其尺寸取決于物鏡和聚光鏡數(shù)值孔徑)所取代，如在圖中所示圖3(a)。 這些波前輸入的物鏡和在后焦平面在創(chuàng)建階段停止的圖像(物鏡瞳孔)。 物鏡后焦平面內(nèi)的是一期環(huán)或片，不僅衰減從聚光鏡的階段停止明亮，直接發(fā)出的光，而且還增加了一個(gè)恒定的相移這個(gè)光。 如果樣品中含有亞結(jié)構(gòu)具有混合的折射率，這些實(shí)體引導(dǎo)從直接波到新路徑的光(圖3中紅色虛線(一))。 由檢體衍射波前(實(shí)際上，包含結(jié)構(gòu)信息的那些)將不會(huì)穿過(guò)物鏡的相位環(huán)，這意味著它們將不會(huì)被衰減或延遲。 所有的波前的終重新組合，以形成由管透鏡的中間圖像。
該已全部在試樣通過(guò)細(xì)節(jié)阻礙不同程度的波前疊加在移和衰減波前在那里放大或衰減彼此(取決于相)的中間圖像中，形成在所觀察到的后的相位對(duì)比圖像目鏡。 中間圖像中這些干擾過(guò)程產(chǎn)生具有在試樣的折射率(和/或厚度)的變化的各種結(jié)構(gòu)的亮區(qū)和暗區(qū)。 對(duì)比度是通過(guò)選擇正確的相位差和衰減值，這是在物鏡孔徑的相位環(huán)的光學(xué)特性的函數(shù)產(chǎn)生。
相襯成像的主要神器出現(xiàn)在周?chē)臉?biāo)本邊界光線明亮的光暈 。 光暈發(fā)生在相差顯微鏡因?yàn)槲挥谖镧R相位片的環(huán)形相位延遲(和中性密度)環(huán)還發(fā)送從試樣小程度的衍射光的(它不限于單獨(dú)通過(guò)環(huán)繞波)。 的問(wèn)題是由以下事實(shí)非衍射光(零階)的寬度包圍波前投影到由聚光環(huán)形相位片比所述相位差板環(huán)的實(shí)際寬度小復(fù)雜。 厚厚的標(biāo)本，常常表現(xiàn)出高度重疊的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生嚴(yán)重的暈文物。 因此，相襯]是只推薦用于非常薄的試樣，其中的幾個(gè)結(jié)構(gòu)不是物理躺在彼此之上的方法。 在厚厚的標(biāo)本，細(xì)節(jié)可以混合成一個(gè)形象，說(shuō)到底，不再是清晰可辨。
相襯要求，配備瞳孔或后孔附近的相環(huán)的特殊物鏡。 它們很容易由綠色碑文，它表示相應(yīng)的聚光鏡相光闌的大小來(lái)識(shí)別：ph1，ph2 ，或ph3的。 如果你持有這樣的物鏡對(duì)光和看到從螺紋端瞳孔，您將可以看到灰色/透明相環(huán)。 聚光鏡需要一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)階段停止時(shí)，根據(jù)附加到所述顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換的相襯物鏡。 與數(shù)值孔徑所需環(huán)直徑增大(高孔所需要的大直徑（ph3），例如0.9在空氣或1.3與浸油)。 三個(gè)尺寸可供與足以為所有物鏡(如圖3(b))。 如果您使用的只有一個(gè)環(huán)的大小相襯，用于聚光鏡容易附著和可拆卸的外掛站就足夠了。 有幾個(gè)坐騎炮塔盤(pán)面較為方便，因?yàn)樗怂械娜嗾?，使成像過(guò)程非?？斓霓D(zhuǎn)換。 附加開(kāi)口可用于必要在明照明和暗視場(chǎng)光闌的孔徑光圈。
它們已被安裝在聚光鏡之后，使得在物鏡光瞳相位光闌的圖像與相環(huán)中的光束路徑的位置正好對(duì)應(yīng)的相位站必須居中(見(jiàn)圖4的(c))。 定心是使用兩個(gè)小扳手(或螺絲起子，取決于顯微鏡模型)聚光鏡的轉(zhuǎn)臺(tái)盤(pán)上進(jìn)行的。 如果你想成為特別精確，使用定心望遠(yuǎn)鏡觀察物鏡后孔作出這些調(diào)整，如圖4所示。這個(gè)小配件看起來(lái)像一個(gè)目鏡和插入觀察筒到位目鏡的說(shuō)明。 當(dāng)望遠(yuǎn)鏡被聚焦在物鏡的光瞳(后孔)，相位停止的位置可以清楚地觀察到。 再次，考慮物鏡瞳孔并把聚光鏡階段停止的鮮明形象重合到與物鏡相環(huán)。 這在圖4在圖4清楚地示出(a)和4(b)所示，相停止不與物鏡相位板對(duì)準(zhǔn)，而停止與相位板是在圖4的(c)完美的一致性。
在相襯一個(gè)標(biāo)本的圖象可以通過(guò)在物鏡的相位環(huán)的仔細(xì)選擇適當(dāng)?shù)剡x擇直接(非衍射)光束的相位差的影響。根據(jù)所選擇的相位差值，具有比其周?chē)叩恼凵渎实膶?duì)象出現(xiàn)或者更亮或比其周?chē)怠?這也被稱(chēng)為正或負(fù)相襯。 在現(xiàn)代顯微鏡，正相對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)象的暗設(shè)有它們的折射率增加。 效果模擬在更高的折射率產(chǎn)生高對(duì)比度特性的區(qū)域吸收到觀察者的眼睛。 這種印象被認(rèn)為是的，特別是與在水性介質(zhì)中的細(xì)胞和組織，因?yàn)榧?xì)胞核和細(xì)胞器，例如，出現(xiàn)比細(xì)胞質(zhì)暗。 對(duì)于一些應(yīng)用，如觀察的精子細(xì)胞，負(fù)相位對(duì)比度可能產(chǎn)生更多的標(biāo)本細(xì)節(jié)比傳統(tǒng)的正相位對(duì)比度。
微分干涉對(duì)比(dic)
微分干涉對(duì)比顯微鏡（dic;圖1(c))的要求平面偏振光和額外的光剪切(諾馬斯基)棱鏡夸大試樣厚度梯度和折射率的微小差異。 脂質(zhì)雙層，例如，產(chǎn)生由于在小區(qū)的水相和脂質(zhì)相之間的折射率的差在dic優(yōu)異的對(duì)比度。 此外，在相對(duì)平坦的粘附哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞，包括質(zhì)膜，細(xì)胞核，液泡，線粒體和應(yīng)力纖維，這通常產(chǎn)生顯著梯度小區(qū)邊界，容易并發(fā)dic成像。 在植物組織中，雙折射細(xì)胞壁降低dic對(duì)比度在有限的程度，但正確對(duì)準(zhǔn)的系統(tǒng)應(yīng)允許核和液泡膜，一些線粒體，葉綠體，并在表皮細(xì)胞稠染色體可視化。 微分干涉反差成像厚植物和動(dòng)物組織，因?yàn)椋嗽黾拥膶?duì)比度，dic展品寬孔口景深減小，創(chuàng)建厚的樣品的薄光學(xué)部分的一個(gè)重要的技術(shù)。 這種效果也是成像粘附細(xì)胞，以減少?gòu)钠∥镌谂囵B(yǎng)基中所產(chǎn)生的模糊是有利的。
微分干涉對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)是基于偏振光對(duì)比度技術(shù)盡可能多使用的組件有關(guān)。 dic對(duì)于現(xiàn)代透射光顯微鏡比在反射光不同的，因?yàn)閮蓚€(gè)雙折射棱鏡被使用(參見(jiàn)圖6)，以及檢體的光程差由折射率差的積求出(試樣和其周?chē)慕橘|(zhì)之間的)和光路上的兩個(gè)點(diǎn)之間通過(guò)的光束穿過(guò)的厚度(幾何距離)(圖5)。 在微分干涉顯微鏡產(chǎn)生的圖像的特征在于*的陰影播送的外觀，就好像它們是從一個(gè)高度傾斜光源從單一方位角始發(fā)照亮。 不幸的是，這種效果，這往往會(huì)呈現(xiàn)在偽三維浮雕檢體(圖6(d))的，經(jīng)常被不知情顯微鏡假定為實(shí)際地形結(jié)構(gòu)的一個(gè)指標(biāo)。
圖6示出了類(lèi)似于偏振透射光的微分干涉對(duì)比光束路徑。 在dic(相對(duì)于偏振光)，兩個(gè)雙折射棱鏡(圖6的(b))被插入到光列車(chē)，一個(gè)在聚光鏡和靠近物鏡光瞳的第二個(gè)。 聚光鏡棱鏡執(zhí)行先前直線偏振光(圖6(c))的一個(gè)矢量分解成垂直地偏振的兩個(gè)彼此振動(dòng)方向，并且橫向以這樣的方式移動(dòng)，這些分光束的波前的一個(gè)小的橫向位移發(fā)生，其中厚度或折射率的區(qū)域而變化。 如果這兩個(gè)部分光束現(xiàn)在通過(guò)*相同的結(jié)構(gòu)，會(huì)發(fā)生在試樣沒(méi)有進(jìn)一步程差(圖5(a)和圖5(c))的。 然而，如果兩個(gè)分光束看到稍微不同的條件下，他們每個(gè)人將經(jīng)歷伴隨它上的剩余行程的中間像平面(圖5(b))的一個(gè)稍有差異的路徑長(zhǎng)度。
如所討論的，分割dic光束進(jìn)入和通過(guò)，他們的波徑是根據(jù)試樣的厚度變化，山坡，和折射率altered試樣。 這些變化會(huì)引起在通過(guò)的任何標(biāo)本細(xì)節(jié)緊貼在一起領(lǐng)域兩個(gè)光束的波路徑變化。 當(dāng)平行光束進(jìn)入物鏡，它們被集中在那里輸入的第二dic棱鏡，結(jié)合了兩個(gè)光束在一個(gè)限定的距離，棱鏡本身以外的后側(cè)焦點(diǎn)面的上方。 此刪除剪切(波之間的距離)和梁對(duì)之間的原始路徑差。 如在穿過(guò)試樣的結(jié)果，平行光束的路徑是相同的長(zhǎng)度(光程差)，用于不同樣品的區(qū)域的不。
為了使光束干涉，不同的路徑長(zhǎng)度的光束的振動(dòng)必須進(jìn)入同一平面及軸。 這是通過(guò)將上部dic光束組合棱鏡上方的第二偏振器(分析器)來(lái)完成。 光然后朝著在那里可以觀察到的強(qiáng)度和顏色差異的目鏡前進(jìn)。 設(shè)計(jì)結(jié)果中的檢體細(xì)節(jié)的一側(cè)出現(xiàn)明亮的(或可能有顏色)，而另一側(cè)看起來(lái)更暗(或其它顏色)。 此陰影效果賦予所述偽三維外觀被上述檢體。 相比，相差顯微鏡有在dic顯微鏡許多優(yōu)點(diǎn)。 與dic，能夠更充分地利用該系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，并以提供光學(xué)染色(色)。 dic還允許顯微鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)出色的分辨率。 充滿物鏡孔徑的使用使得該顯微鏡專(zhuān)注于一個(gè)厚的樣品的薄平面部分，而不從平面的上方或下方混淆圖像。 惱人的光暈，在相襯經(jīng)常遇到，是在dic圖像不存在，以及適當(dāng)?shù)南詈臀炇镧R可以用于這項(xiàng)工作。 重要的是要記住，是很重要的，然而，由于dic是基于偏振光原理，高雙折射標(biāo)本或那些嵌在雙折射材料不應(yīng)dic下觀察。
霍夫曼調(diào)制和varel對(duì)比
比喻通常被稱(chēng)為“窮人的dic”，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度（hmc）是一個(gè)斜照明技術(shù)，增強(qiáng)了通過(guò)檢測(cè)光學(xué)相位梯度的活細(xì)胞和組織的對(duì)比(見(jiàn)圖1(d))。 基本顯微鏡配置包括光學(xué)振幅空間濾波器，稱(chēng)為調(diào)制器，其被插入到物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面。 光強(qiáng)度通過(guò)調(diào)制器的上方和下方的平均值，根據(jù)定義，然后所述待調(diào)制而變化。 耦合到物鏡調(diào)制器是放置在聚光鏡前焦平面引向試樣偏斜照明離軸狹縫孔。 不像在相差顯微鏡的相位板，所述霍夫曼調(diào)制器的設(shè)計(jì)不改變穿過(guò)的光的相位; 相反，它影響的主要零階極大產(chǎn)生對(duì)比。 霍夫曼調(diào)制對(duì)比不被使用在光學(xué)路徑雙折射材料(如塑料陪替氏培養(yǎng)皿)的阻礙，因此，該技術(shù)是用于檢查在與聚合材料構(gòu)成的容器的標(biāo)本更為有用。 在下行路上，hmc產(chǎn)生了許多渲染技術(shù)，一定程度上比相襯或dic對(duì)蓋玻片活細(xì)胞成像用處不大的光學(xué)構(gòu)件。
新開(kāi)發(fā)的對(duì)比技術(shù)，其中相差與傾斜單側(cè)照明(類(lèi)似于hmc)相結(jié)合，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了活細(xì)胞在培養(yǎng)容器中的檢查。 形如環(huán)形扇區(qū)的附加停止使用在照明側(cè)，允許單邊傾斜照明。 三個(gè)照明模式，單側(cè)暗場(chǎng)，varel(可變浮雕)對(duì)比度和傾斜明(類(lèi)似于偏斜照明或hmc)由來(lái)自外部的移位停止在徑向方向上的內(nèi)側(cè)設(shè)置(見(jiàn)圖7)和一個(gè)段匹配環(huán)形移入位置。 該縫隙指示源照明穿過(guò)高吸收對(duì)物鏡孔的外圍，其通過(guò)依賴于外圈的密度的量抑制其強(qiáng)度的第二環(huán)。 光的衍射級(jí)通過(guò)物鏡而不受varel環(huán)被抑制。 如果要發(fā)生變化的源照明被抑制的程度也可以操縱該狹縫的位置。
取向是容易實(shí)現(xiàn)和由于狹縫的同心性維護(hù)。 此外，因?yàn)樵谖镧R的varel環(huán)位置的，varel和相襯環(huán)可在相同的物鏡相結(jié)合。 這使得在培養(yǎng)容器中的成像單元的一個(gè)非常低的價(jià)格的方法。 成像在傳統(tǒng)和常規(guī)組織培養(yǎng)應(yīng)用的問(wèn)題都可以用這種方法來(lái)解決，這是活的對(duì)象(顯微)的檢查成功選項(xiàng)，以及具有不同光學(xué)厚度的范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)很容易與varel成像。 即使有一個(gè)彎曲的底培養(yǎng)容器允許產(chǎn)生一個(gè)有用的圖像。 相襯獨(dú)自有時(shí)會(huì)失敗，在這種情況下，因?yàn)橐粋€(gè)彎曲的腔底座就像一個(gè)鏡頭，損害相環(huán)的疊加。 滑塊包括兩個(gè)所提及的扇區(qū)，以允許從左側(cè)或右側(cè)進(jìn)行照明，根據(jù)需要。 這使得有可能對(duì)比電池甚至鄰近在微量滴定板中的孔的邊緣。
暗場(chǎng)照明
周?chē)陌狄曇帮@微鏡的方法，雖然被廣泛用于成像整個(gè)19世紀(jì)和20世紀(jì)透明標(biāo)本，在使用僅限于物理隔離的細(xì)胞和生物體(如圖1給出(e))。 在該技術(shù)中，聚光鏡引導(dǎo)光錐到在高方位角檢體，使得階波前不直接進(jìn)入物鏡前透鏡元件。 光穿過(guò)樣品被衍射，反射，和/或通過(guò)光學(xué)不連續(xù)性(如細(xì)胞膜，細(xì)胞核和內(nèi)部細(xì)胞器)使這些微弱光線進(jìn)入物鏡折射。 然后，標(biāo)本可以看作對(duì)一個(gè)原本黑色的背景明亮的物體。 不幸的是，由從焦平面除去對(duì)象散射光也向圖像，從而降低對(duì)比度和模糊檢體的細(xì)節(jié)。 這個(gè)偽影的事實(shí)，灰塵和碎屑在成像室也顯著向所得圖像有助于復(fù)雜。 此外，薄的粘附細(xì)胞經(jīng)常遭受非常微弱的信號(hào)，而厚植物和動(dòng)物組織重定向太多的光到物鏡路徑，減少了技術(shù)的有效性。
近，結(jié)合熒光顯微鏡一起使用時(shí)在發(fā)送暗場(chǎng)顯微術(shù)的新興趣已經(jīng)出現(xiàn)由于它的優(yōu)點(diǎn)。 暗視野顯微術(shù)是一種專(zhuān)門(mén)的照明技術(shù)，該技術(shù)利用了偏斜照明中，如上所述，以提高在該不能很好在正常明照明條件成像標(biāo)本的對(duì)比度。 人工黑暗的背景中在聚光鏡使用的環(huán)形止顯微鏡創(chuàng)建(見(jiàn)圖8)。 雖然聚光鏡光學(xué)然后照射樣品，他們這樣做與光的通過(guò)在所有方位角在其角度檢體傳遞的中空倒錐形，使得僅光與標(biāo)本特征的交互是能夠進(jìn)入顯微鏡物鏡以形成疊加到一個(gè)黑暗的背景標(biāo)本的鮮明形象。 創(chuàng)造高角，它是必要的物鏡孔徑為比照明光錐的內(nèi)孔徑較小(見(jiàn)圖8的(a))。 然而，具有集成可變光圈的物鏡還提供快門(mén)出即使它落入物鏡的孔徑錐間接光(如在圖8(b)所示)。 這允許用于暗場(chǎng)照明采用非常高的孔。 暗視野顯微鏡是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的工具。 它可以以高倍率有效地用于圖像活的細(xì)菌，或在低倍率查看和圖像的細(xì)胞，組織和整個(gè)支架。
偏振光
偏振光顯微鏡是一個(gè)對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)，顯著地改善與其它技術(shù)相比，如明場(chǎng)和暗場(chǎng)照明，相差，微分干涉對(duì)比，熒光，和霍夫曼調(diào)制對(duì)比時(shí)與雙折射材料獲得的圖像的質(zhì)量。 偏光顯微鏡具有高度的敏感性，并且可用于針對(duì)廣泛的各向異性標(biāo)本的定性和定量研究。 定性偏光顯微鏡頗為流行的做法，但是，偏光鏡的數(shù)量方面，這是在晶體主要應(yīng)用，代表了更棘手的問(wèn)題是主要由礦物學(xué)家，地質(zhì)學(xué)家，化學(xué)家和。 過(guò)在高度敏感的偏振光顯微鏡在過(guò)去幾年取得了穩(wěn)步的進(jìn)展已經(jīng)允許生物學(xué)家審查的幾個(gè)各向異性亞細(xì)胞集的雙折射性質(zhì)。
偏振光顯微鏡(圖1(f))的通過(guò)查看插入到聚光鏡之前的光列車(chē)和物鏡后交叉偏振元件之間的樣品進(jìn)行的。具有雙折射特性，如植物細(xì)胞壁，淀粉顆粒，和有絲分裂紡錘體，以及肌肉組織中的細(xì)胞，內(nèi)組件旋轉(zhuǎn)光偏振面，在暗背景上顯示鮮艷。 在圖1(f)中所示的兔肌肉組織是施加到活組織觀察偏光顯微鏡的一個(gè)例子。 注意，這種技術(shù)是由雙折射的發(fā)生在活細(xì)胞和組織的限制，并且還沒(méi)有被充分開(kāi)發(fā)。 如上所述，微分干涉對(duì)比操作通過(guò)將一對(duì)匹配的相對(duì)的交叉偏振器之間諾馬斯基棱鏡，使裝備dic觀察任何顯微鏡還可以采用審查平面偏振光試樣簡(jiǎn)單地通過(guò)從光路徑除去棱鏡。
有在偏振顯微鏡兩枚偏光元件(參見(jiàn)圖9)。 偏振器置于與固定在東 - 西方向其振動(dòng)方位角的試樣臺(tái)下方。 注意大多數(shù)商業(yè)顯微鏡這些元素可通過(guò)360度旋轉(zhuǎn)。 另一個(gè)極化(分析器)，這通常是與面向北南(但在一些顯微鏡再次轉(zhuǎn)動(dòng))的振動(dòng)方向?qū)R，置于物鏡上方并可以移入和移出作為所需要的光路的。 當(dāng)兩個(gè)偏振器和分析器被插入到光路中，其振動(dòng)方位角被定位成直角彼此。 在這種結(jié)構(gòu)中，偏振器和分析器被劃掉，沒(méi)有光穿過(guò)光學(xué)系統(tǒng)和黑暗的背景中存在的目鏡一個(gè)(圖9的(a))。 線性偏振光波被從振動(dòng)方向在自然光線通行的統(tǒng)計(jì)混亂篩選出特權(quán)平面偏光片產(chǎn)生。 光(普通和特殊波)的兩個(gè)正交分量在通過(guò)檢體不同的速度行進(jìn)，并且作為結(jié)果，觀察不同的折射率，被稱(chēng)為雙折射 (來(lái)自術(shù)語(yǔ)雙重或雙折射衍生)的現(xiàn)象。 雙折射的定量度量等于所述波前折射率之間的數(shù)值差。 更快的波前首先出現(xiàn)從試樣產(chǎn)生具有較慢波前的光程差。 分析器重組兩個(gè)波前在相同的方向上行進(jìn)，并在同一平面中振動(dòng)的分量。 這種偏光元件確保兩個(gè)波前必須在重組的大對(duì)比度時(shí)的相同的幅度。
為偏振光成像的適當(dāng)?shù)呐渲檬窍鄬?duì)容易實(shí)現(xiàn)的幾乎任何顯微鏡。 聚光鏡(靠近孔徑光闌)下方偏振片確保樣品與通過(guò)聚光鏡直線偏振光的波前照射(參照?qǐng)D9的(a))。 分析器(第二偏振片)，其被定向以設(shè)置在90度到偏振片的角度的方位角，位于物鏡的后面。 管透鏡形成中間圖像，這是通過(guò)目鏡或到照相機(jī)成像平面投影。 如果沒(méi)有檢體放置在顯微鏡工作臺(tái)上，現(xiàn)場(chǎng)通過(guò)目鏡觀察將保持*黑暗。 當(dāng)照射時(shí)，許多標(biāo)本轉(zhuǎn)動(dòng)偏振光的振動(dòng)方向出由偏振片產(chǎn)生的平面。 這種標(biāo)本主要由雙折射材料，其中，折射率取決于入射光的振動(dòng)方向。 這主要是與晶體，例如淀粉或礦物質(zhì)(圖9的(c))的情況下，但也會(huì)發(fā)生與纖維(圖9(d))和聚合物。 如果這樣的材料的交叉偏振器和分析器之間的偏振顯微鏡下觀察，明亮的部分可以在圖像中可以看出，因?yàn)楣獗徊糠值赜煞治鰞x發(fā)送。
偏振光顯微鏡的光學(xué)列車(chē)還可以包括被稱(chēng)為一個(gè)lambda或相位差板的輔助元件(圖9(a)和圖9(b))是，在定量分析時(shí)使用。 在偏振光，這拉姆達(dá)板轉(zhuǎn)換成對(duì)比的顏色。 如在相襯，光程差引起的顏色，雖然這一次在試樣偏振光和雙折射材料。 產(chǎn)生的潛在客戶通過(guò)干擾光線特定波長(zhǎng)的消光路徑差(只有某些顏色保持從白光和創(chuàng)造美麗，彩色照片)。 偏光顯微鏡提供的大約的范圍內(nèi)的樣品的組合物和三維結(jié)構(gòu)的信息的巨大的量。 在其范圍內(nèi)幾乎是無(wú)限的，該技術(shù)可以揭示關(guān)于熱歷史以及其中試樣形成期間經(jīng)受的應(yīng)變信息。 在制造和研究有價(jià)值，偏光顯微鏡是相對(duì)便宜和可訪問(wèn)的研究和質(zhì)量控制工具，它可以為用戶提供的任何其他技術(shù)不可用的信息。