. 引言
沃特世xbridge beh sec 200å和450å 3.5 μm蛋白分析柱，設(shè)計(jì)用于補(bǔ)充現(xiàn)有基于uplc的sec應(yīng)用，配合傳統(tǒng)hplc系統(tǒng)按sec方法檢測(cè)肽或蛋白。這些新的hplc型sec填料，基于沃特世亞乙基橋雜化（beh）顆粒技術(shù)及其表面覆蓋的二醇基鍵合相，與已經(jīng)得到成功運(yùn)用的uplc sec柱系列的色譜填料化學(xué)性質(zhì)*一致。這為了色譜技術(shù)人員提供了更多選擇，能夠基于實(shí)驗(yàn)室儀器平臺(tái)與樣品組分分離度情況或樣品分析通量需求輕松轉(zhuǎn)換。
所有基于beh的sec色譜柱，都是在通過cgmp（現(xiàn)行g(shù)mp）和iso9001認(rèn)證的工廠里采用超純?cè)噭┥a(chǎn) 而得。生產(chǎn)出的每個(gè)批次填料，經(jīng)過一系列標(biāo)準(zhǔn)qc測(cè)試（例如，粒徑與孔徑分布），之后使用合適的肽和蛋白混標(biāo)進(jìn)行特定應(yīng)用測(cè)試。然后，對(duì)每一批獲得批準(zhǔn)放行的填料所裝填出的每一根sec色譜柱，再進(jìn)行柱效測(cè)試。通過這樣的質(zhì)控過程，來確保在研發(fā)或?qū)Ω咭蟮尿?yàn)證方法提供批與批間、柱與柱間的重現(xiàn)性。
圖1. 在xbridge beh sec 200å和450å蛋白分析柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ii. 用于sec蛋白質(zhì)分離的系統(tǒng)因素
a.啟動(dòng)
為了獲得沃特世 xbridge beh sec蛋白分析柱的*性能，正確配置您的lc系統(tǒng)很重要。我們建議只使用預(yù)切管路，且所有連接管的內(nèi)徑為0.005”或更小，以達(dá)到*色譜性能。
對(duì)于既有l(wèi)c系統(tǒng)，要進(jìn)行sec分析，可能需要進(jìn)行一些改造。請(qǐng)參考“使用acquity uplc系統(tǒng)進(jìn)行分子排阻色譜和離子交換色譜分析蛋白質(zhì)”
所采用的樣品環(huán)也可能影響您的分離性能。理想情況下，選擇應(yīng)用所需的zui低容量的樣品環(huán)。不建議使用大于20 μl的樣品環(huán)。
b.色譜柱的安裝
1. 將色譜柱接入系統(tǒng)之前，清除溶劑輸送系統(tǒng)中的任何有機(jī)溶劑或與水不互溶的流動(dòng)相。連接色譜柱時(shí)，按照色譜柱入口端側(cè)面上指示正確溶劑流向的箭頭方向，安裝色譜柱。
2. 用100%水相緩沖鹽，以0.2 ml/min的流速?zèng)_洗色譜柱。
3. 確保流動(dòng)相從色譜柱出口端順利流出。用內(nèi)徑為0.004” 的管路（部件號(hào)430001562），將色譜柱出口端連接至檢測(cè)器。監(jiān)視系統(tǒng)壓力，確保色譜柱處于其壓力限度以內(nèi)。
4. 逐漸提高流速，每次步進(jìn)不超過0.1ml/min，如第2步所述。
5. 一旦系統(tǒng)壓力穩(wěn)定了，確保無論是色譜柱進(jìn)口端還是出口端都沒有漏液。
c. 色譜柱的平衡
xbridge beh sec蛋白分析柱，保存在20%的甲醇水溶液中裝運(yùn)。在將其轉(zhuǎn)化到不同的流動(dòng)相體系之前，確保流動(dòng)相兼容性是至關(guān)重要的。zui少用10倍柱體積的緩沖液來平衡色譜柱（有關(guān)色譜柱體積，請(qǐng)參閱表1）。
表1.空色譜柱體積（單位：ml）（乘以10即為沖洗溶劑體積）。
d. 用于標(biāo)定lc系統(tǒng)和xbridge beh sec蛋白分析柱的功能測(cè)試
沃特世建議，您在收到色譜柱后以及在柱的整個(gè)使用壽命周期內(nèi)，都要進(jìn)行標(biāo)定測(cè)試。通過用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)常規(guī)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，您可以：
■收貨后就確定色譜柱的性能。
■監(jiān)測(cè)色譜柱狀態(tài)，以延長(zhǎng)使用期。
■對(duì)可能發(fā)生的分離問題進(jìn)行故障排查。
沃特世beh200 sec蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）和beh450 sec蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006842）即專門為此目的所設(shè)計(jì)的產(chǎn)品，經(jīng)仔細(xì)選擇的蛋白質(zhì)和/或肽，可以很好地代表目標(biāo)應(yīng)用。
如下信息詳盡描述了如何配制和使用beh sec蛋白質(zhì)混標(biāo)來進(jìn)行系統(tǒng)基準(zhǔn)化或故障排查。圖2和3提供了分離條件和預(yù)期您應(yīng)該獲得的結(jié)果。
流動(dòng)相配制
化學(xué)品：
■單水合*
■無水*
■hplc級(jí)別水
配制100 mm磷酸鈉緩沖液（500ml）：
1. 量取500±0.02 g水至500 ml燒杯
2. 量取3.55±0.02 g*，放入500 ml燒杯
3. 量取3.45±0.02 g*，放入500 ml燒杯
4. 攪拌至少30分鐘，然后用0.2 µm膜過濾
5. 測(cè)量ph值并記錄以參考（ph值約為：6.8）
圖2.在xbridge beh sec 200, 3.5 μm, 7.8x150蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離。
表2. beh200 sec測(cè)試混標(biāo)。
條件：
儀器： acquity uplc系統(tǒng)，配tuv檢測(cè)器
色譜柱： acquity uplc beh200 sec, 200å, 3.5μm,7.8 x 150mm
樣品： beh200 sec蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）
流動(dòng)相： 100 mm磷酸鈉，ph 6.8
弱針洗： 100%的milli-q 水
強(qiáng)針洗： 100%的milli-q 水
密封墊沖洗： 90/10水/甲醇
進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)
進(jìn)樣量： 2 μl
流速： 0.86 ml/min
柱溫： 室溫
檢測(cè)： uv@280 nm
圖3. 在xbridge beh sec 450, 3.5 μm, 7.8 x150 mm蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離
表3. beh450 sec測(cè)試混標(biāo)。
條件：
儀器： acquity uplc系統(tǒng)，配tuv檢測(cè)器
色譜柱： xbridge beh sec蛋白分析柱，450å, 3.5 μm, 7.8 x 150 mm
樣品： beh200 sec蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號(hào)186006518）
流動(dòng)相： 100 mm磷酸鈉，ph 6.8
弱針： 100%的milli-q 水
強(qiáng)針洗： 100%的milli-q 水
密封墊沖洗： 90/10水/甲醇
進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)
進(jìn)樣量： 2 μl
流速： 0.86 ml/min
柱溫： 室溫
檢測(cè)： uv@280 nm
iii. 色譜柱指標(biāo)與使用
為確保xbridge beh sec 3.5 μm蛋白分析柱持久的高性能，請(qǐng)遵守以下操作規(guī)范：
a. sec洗脫液與針洗液的制備
■如果可能，請(qǐng)使用hplc級(jí)的緩沖液、水和有機(jī)溶劑。
■使用0.2 μm或更小孔徑的濾膜過濾溶液。對(duì)于可以滋生微生物的緩沖液，*使用無菌過濾裝置。
■容易滋生微生物的溶液應(yīng)定期更換，以避免色譜柱污染。不要把新配制流動(dòng)相又倒入舊的sec流動(dòng)相樣品瓶中。新鮮配制的sec流動(dòng)相，應(yīng)該使用新的溶劑瓶。
■選擇與所用溶液兼容的溶劑進(jìn)樣口過濾器。當(dāng)使用容易滋生微生物的溶液時(shí)，要定期清洗或更換過濾器。
b. 樣品制備
■在進(jìn)樣到sec色譜柱上之前，確保樣品中沒有微粒。如果樣品出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致柱壓 升高?？梢缘脑挘褂眠^濾或離心方式制備樣品。
■如果樣品不能溶解于流動(dòng)相，請(qǐng)確保樣品、樣品溶劑和 流動(dòng)相可以互溶，以避免樣品和/或緩沖鹽沉淀。
c. 色譜柱指標(biāo)
■柱裝運(yùn)溶劑：20%的甲醇水溶液
■*zui大流速和背壓：
■ xbridge beh sec 200蛋白分析柱，7.8 x 150 mm:4 ml/min/2,600 psi
■ xbridge beh sec 200蛋白分析柱，7.8 x 300 mm:2.7 ml/min/3,200 psi
■ xbridge beh sec 450蛋白分析柱，7.8 x 150mm:4 ml/min/2600psi
■ xbridge beh sec 450蛋白分析柱，7.8 x 300mm:2.7 ml/min/3200psi
■ 樣品質(zhì)量載量：< 300 μg（對(duì)于7.8x150mm）
■樣品體積載量：< 60 μl（對(duì)于7.8x 150 mm）
■ *的ph值范圍：2～8。色譜柱使用壽命會(huì)隨操作溫度以及所用緩沖液的類型和濃度的不同而有所不同。
■*的鹽濃度：小于或等于0.5 m
■*的有機(jī)相濃度：< 20% 乙腈（警告：許多蛋白質(zhì)在高比例有機(jī)相中不可溶。）進(jìn)行色譜分析前，進(jìn)行測(cè)試以確保樣品在擬用于色譜分析的有機(jī)相濃度下不會(huì)發(fā)生沉淀。此外，如果色譜柱在蛋白變性條件（大于10%的有機(jī)相）下運(yùn)行，之后在100%水相條件下使用時(shí)色譜柱性能可能會(huì)受到影響。
■*溫度：4 – 60°c。低溫（例如10°c）下操作時(shí)要降低流速，以免柱壓過大。
■ *儲(chǔ)存：若要隔夜儲(chǔ)存，用流動(dòng)相以10-20%的zui大*流速持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時(shí)內(nèi)使用，可將柱保存于hplc級(jí)純水中；或放在10-20%的甲醇中進(jìn)行*儲(chǔ)存。
注：在壓力、ph值和/或溫度下操作時(shí)，會(huì)致使色譜柱使用壽命變短。
iv. 故障排查
系統(tǒng)性故障排查的*步，是將色譜柱當(dāng)前狀態(tài)下的性能與正常工作時(shí)的性能進(jìn)行比較。用蛋白質(zhì)混標(biāo)進(jìn)行功能測(cè)試，可揭示柱填料表面化學(xué)的微妙變化對(duì)應(yīng)用的影響。
有幾種常見的色譜柱變化癥狀：
1. 壓力升高通常與應(yīng)用中的性能下降在一起。診斷的*步是確保壓力升高發(fā)生在色譜柱中，而不是在系統(tǒng)中的其他地方。這可通過從出口端到進(jìn)口端逐一斷開連接并同時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)壓力情況來確定。如果系統(tǒng)被堵塞，則應(yīng)查明堵塞處并排除堵塞。如果增高壓力發(fā)生在色譜柱中，了解問題是與單次進(jìn)樣有關(guān)還是發(fā)生在一系列進(jìn)樣后會(huì)很有幫助。如果壓力是逐漸形成的，則很可能需要按第五節(jié)所述對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗。如果是一個(gè)樣品造成的壓力上升，則很可能表示有顆?；虿豢扇艿某煞郑缰惢蜉^高階聚合物。清洗仍然是一種選擇，但要采用更激烈的方式。如果樣品溶液出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致壓力升高?？梢赃M(jìn)行樣品制備例如過濾或離心，但首先應(yīng)檢查是否會(huì)影響結(jié)果。
2. 微生物污染會(huì)造成分離度損失和峰拖尾增加。重要的是，遵循良好的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范以預(yù)防微生物污染，包括經(jīng)常更換緩沖液溶劑瓶、使用高純度水、使用無菌過濾裝置、以及在建議的條件下保存系統(tǒng)和色譜柱。如果已經(jīng)發(fā)生微生物污染，清洗色譜柱不會(huì)影響性能。改變流速時(shí)，請(qǐng)按0.1 ml/min的步進(jìn)速度緩慢增加，避免流速增加時(shí)大于0.1 ml/min步進(jìn)。
3. 峰拖尾增加，可能是由于管路連接不當(dāng)，或是由于色譜柱進(jìn)樣端篩板上的物質(zhì)積聚。在繼續(xù)進(jìn)行診斷或采取糾正措施前，請(qǐng)檢查所有的管路連接、流動(dòng)相是否制備得當(dāng)、并選擇了正確的方法。然后重復(fù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。 如果蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品都呈現(xiàn)峰拖尾增加，則很可能在色譜柱入口端有顯著的物質(zhì)累積問題，需要更換色譜柱。
4. 殘留是指一次進(jìn)樣的樣品組分出現(xiàn)在下一次分析譜圖中。在sec中，殘留一般是由系統(tǒng)部件或不正確的清洗溶劑造成的。進(jìn)行一次空白進(jìn)樣。如果蛋白質(zhì)峰值僅出現(xiàn)在進(jìn)樣時(shí)，則它們很可能源于系統(tǒng)部件或清洗溶劑不足。系統(tǒng)部件中的吸附zui可能發(fā)生在進(jìn)樣環(huán)或 針中。在這些情況下，可能需要更換部件。
v. 色譜柱清洗、再生與儲(chǔ)存
a. 清洗與再生
峰形的變化，如增加拖尾、肩峰、保留時(shí)間改變、分離度變化、鬼峰或柱背壓升高，都可能表示色譜柱被污染了。選擇一種有望解決疑似污染的清洗方法。
按該色譜柱所采用的典型流速的一半來執(zhí)行清洗程序可能有用。用這種方式，降低了高背壓事件的發(fā)生概率。
*的清洗溶劑：
a. 低ph值的高濃度鹽溶液（如：0.5 m na2so4, ph 2.7）
b. 低濃度甲醇（如：20%）溶于hplc級(jí)的水中。
c. 如果色譜柱隨后要用于分析天然形態(tài)的蛋白質(zhì)，應(yīng)避免使用離子型洗滌劑和其他表面活性劑。
注：根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇清洗溶劑，如：用(a)去除堿性蛋白， 用(b)去除疏水性蛋白。消泡劑（chaotropic agents）通過干擾氫鍵作用使強(qiáng)烈吸附的蛋白質(zhì)溶劑化。
作為后的手段，可以嘗試在低流速（如0.1 ml/min）下進(jìn)行倒 流或反沖洗。然而，這種方法可能會(huì)進(jìn)一步損害色譜柱，或者只能提供短暫的性能改進(jìn)。
b. 儲(chǔ)存
若要隔夜儲(chǔ)存，用流動(dòng)相以10～20%的zui大*速度持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時(shí)內(nèi)使用，將色譜柱儲(chǔ)存在hplc級(jí)的純水中；或放在20%的甲醇中作為*儲(chǔ)存。
注：在壓力、ph和/或溫度條件下操作，會(huì)縮短色譜柱使用壽命。