dna提取方法的一些總結:細菌dna的提?。?br>(一)
試劑:
1. 抽提緩沖液
2% ctab (w/v)
2% pvp k25 (w/v) (去色素)
100mm tris-hcl (ph8.0)
25mm edta (ph8.0)
2.0m nacl
2.10m licl
3. 2m licl
4.depc-water(抑制rna酶活性)
5. 3m naac (ph5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步驟:
1.抽提緩沖液65℃預熱;
2. 加菌體到已經(jīng)預熱的緩沖液(700ul)中混勻,65℃,10min;
3. 加酚/lv仿/異戊醇(25:24:1),振蕩,離心12,000rpm,10min;
4.取上清,加lv/異戊醇(24:1)振蕩,離心12,000rpm,10min;
5. 取上清,重復4步驟;
6. 加入1/10體積的3m醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的異丙醇),-20c沉淀;
11. 離心12,000rpm,10min;
12. 棄上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。
(二)(我們常用的方法,但是有時有些細菌特別不好提,就用上面的方法)
1. 將菌株接種于液體lb培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)過夜。
2. 取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的te緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30ul 10%sds和15ul的蛋白酶k,混勻,于37℃溫育1h.
4. 加入100ul 5mol/l nacl, 充分混勻,再加入80ul ctab/nacl溶液,混勻后再65℃溫育10min。
5. 加入等體積的酚/lv/異戊醇混勻,離心4-5min, 將上清轉入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到dna沉淀下來,沉淀可稍加離心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇.
真菌dna的提取:
(一)
1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4ml提取液,快速振蕩混勻
3.加入等體積的4ml的lv:異戊醇(24:1),渦旋3~5min(此處是粗提沒有加酚,可以節(jié)約成本的喲?。?br>4.1000rpm,4℃,5min
5.上清用體積的lv:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃離心5 min)
6.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
7.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干,重懸于500 ?ulte中
8.加入1 ul rnasea (10 mg/ml),37℃處理1 hr
9.用酚(ph8.0):lv仿:異戊醇(25:24:1)和lv仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)
10.取上清,1/10v 3m naac,2.5v體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗,風干, 溶于200 ulte中,-20 ℃保存?zhèn)溆?br>dna提取液:0.2m tris-hcl(ph 7.5),0.5m nacl,0.01m edta,1%sds,
3m naac
(二)
1.真菌菌絲0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 ml 65℃預熱的dna提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30 min, 期間混勻2-3次
3.加入1 ml 5m kac,冰浴20 min
4.等體積的lv仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)
5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇, 混勻, 靜置約30 min
6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干,重懸于500 ?l te中
7.加入1 ul rnasea (10 mg/ml),37℃處理1 hr
8.用酚(ph8.0):lv仿:異戊醇(25:24:1)和lv仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)
9.取上清,1/10v 3m naac,2.5v體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,風干, 溶于200 ul te中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br>注:僅供參考!