中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb/t 42113-2022
農(nóng)產(chǎn)品中生氰糖苷的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
determination of cyanogenic glycosides in agricultural products-
liquid chromatography with tandem-mass spectrometry method
1范圍
本文件描述了農(nóng)產(chǎn)品中亞麻苦苷、β-龍膽二糖丙酮氰醇、百脈根苷、β-龍膽二糖甲乙酮氰醇、紫杉氰苷、蜀黍苷、苦杏仁苷、黑野櫻苷的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于木薯、亞麻籽、高粱、竹筍、杏仁等農(nóng)產(chǎn)品中生氰糖苷含量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣中生氰糖苷，經(jīng)80%甲醇水溶液提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，外標(biāo)法定量。
5試劑和材料
除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑，以及符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1甲醇(ch3oh，cas號：67-56-1)：色譜純。
5.1.2乙腈(ch3cn，cas號：75-05-8)：色譜純。
5.1.3甲酸(hcooh，cas號：64-18-6)：色譜純。
5.2試劑配制
5.2.1 0.1%甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))：準(zhǔn)確吸取1.00 ml甲酸(5.1.3)，用水定容至1 l。
5.2.2 80%甲醇水溶液(體積分?jǐn)?shù))：量取80 mi，甲醇(5.1.1)，加20 ml水.混勻。
5.2.3 10%甲醇水溶液(體積分?jǐn)?shù))：量取10 ml甲醇(5.1.1)，加90 ml水，混勻。
5.2.4 30%甲醇乙腈溶液(體積分?jǐn)?shù))：量取30 ml，甲醇(5.1.1)，加70 ml乙腈(5.1.2)，混勻。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
8種生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%，其基本信息見附錄a。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100 mg/l)：分別準(zhǔn)確稱取生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇(5.1.1)溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，配成質(zhì)量濃度為100 mg/l標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-18℃保存，保存期2個月。
5.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 mg/l)：分別移取100μl的8種生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(5.4.1)于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，得1 mg/l標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。現(xiàn)配現(xiàn)用。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：n-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(200 mg/6 ml)，或其他等效柱。使用前用2ml甲醇和2ml水依次活化。
5.5.2微孔濾膜：0.22μm有機系。
6儀器和設(shè)備
6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。
6.2分析天平：感量0.1 mg和0.01 mg。
6.3分析研磨機。
6.4渦旋振蕩器。
6.5離心機：轉(zhuǎn)速≥4 200 r/min，帶有15 ml轉(zhuǎn)子。
6.6固相萃取裝置。
6.7超聲波清洗器(總功率900 w)。
6.8氮吹儀。
7試樣制備與保存
取500 g左右樣品，用水洗凈表面附著的雜物，吸水紙擦干水分，切碎，裝入樣品袋中，充分混勻，裝入研磨杯，加入液氮冷凍，用研磨機粉碎至顆粒均勻，放入分裝容器中，密封，按照第8章規(guī)定的順序完成，或放于-18℃凍存1個月。
8測定步驟
8.1提取
稱取1 g試樣(精確到0.1 mg)于15 ml離心管中，加入3 ml 80%甲醇水溶液(5.2.2)，渦旋振蕩15 s，超聲提取15 min，立即于4 200 r/min離心10 min，取全部上清液；向殘渣中再次加入3 ml 80%甲醇水溶液<5.2.2)，按上述條件提取、商心，合并兩次提取液于10 ml.容量瓶中，加水至刻度線，混勻，待凈化。
8.2凈化
將活化好的固相萃取柱(5.5.1)連接到固相萃取裝置(6.6)。將8.1中制備的粗提液轉(zhuǎn)移至萃取柱中，待樣液全部流過柱子后，棄去流出液。用2 ml水淋洗柱子并徹底抽干，棄去淋洗液。用3 ml 30%甲醇乙腈溶液(5.2.4)洗脫柱子，分次洗脫，每次1 ml，流速1 ml/min，收集全部洗脫液。洗脫液氮氣吹干(40℃)后，用1 ml 10%甲醇水溶液(5.2.3)復(fù)溶。過0.22μm濾膜(5，5.2)，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
8.3測定
8.3.1色譜參考條件
液相色譜參考條件如下：
a)色譜柱：c18(50 mm×2.1 mm，1.8μm)色譜柱，或同等性能的色譜柱；
b)流動相及洗脫條件見表1；
c)流速：0.2 ml/ min；
d)柱溫：30℃；
e)進樣量：10μl。
8.3.2質(zhì)譜參考條件
質(zhì)譜參考條件如下：
a)離子源：電噴霧離子源；
b)掃描方式：正離子掃描模式；
c)干燥氣溫度：325℃；
d)干燥氣流量：5 l/min；
e)鞘氣溫度：350℃；
f)鞘氣流速：11 l/min；
g)霧化氣壓力：45 mpa；
h)毛細(xì)管電壓：3 500 v；
i)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；
j)監(jiān)測離子對、碰撞能量見表2。
8.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5.4.2)，用10%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋成5μg/l、10μg/l、25μg/l、50μg/l、100μg/l.200μg/l的亞麻苦苷、β-龍膽二糖丙酮氰醇、百脈根苷、β-龍膽二糖甲乙酮氰醇、紫杉氰苷、蜀黍苷、苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及25μg/l、50μg/l、100μg/l、150μg/l、200μg/1的黑野櫻苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，以待測物的特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.3.4定性測定
用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液。在相同實驗條件下，待測物在樣品中的保留時間與在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的保留時間偏差在±2.5%以內(nèi).并且色譜圖中各組分定性離子對的相對豐度，與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作液中相應(yīng)定性離子對的相對豐度相比，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷為樣品中存在對應(yīng)的待測物。
8.3.5定量測定
用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積按外標(biāo)法定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到化合物濃度，平行測定不少于兩次。當(dāng)樣品中化合物濃度超過標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍時，用10%甲醇水溶液(5.2.3)適當(dāng)稀釋。在上述色譜和質(zhì)譜條件下，8種生氰糖苷的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄b。
9結(jié)果計算與表述
試樣中生氰糖苷化合物含量ωi按式(1)計算：
式中：
ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣溶液中生氰糖苷化合物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/l)；
v——樣品溶液定容體積，單位為毫升(ml)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；
f——稀釋倍數(shù)。
計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
10精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立的測試結(jié)果的絕對差值不大于算術(shù)平均值的20%。
11檢出限與定量限
生氰糖昔化合物的檢出限和定量限見表4。