組織樣本 dna 純化
大多數(shù)動物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 k 進行效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊,有條件的話建議使用 tissuelyser 或研缽等提前進行均質(zhì)化。骨骼肌,心臟,皮膚等組織含有收縮蛋白,結(jié)締組織和膠原蛋白,所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 k 進行充分消化是必須的。
ffpe 樣本進行 dna 純化時需要預裂解。福爾馬林可由 pbs 洗滌除去,石蠟可由甲苯和乙醇進行去除。在蛋白酶消化后提孵育的溫度有助于逆轉(zhuǎn)交聯(lián),以便更好的從 ffpe 組織中釋放 dna,從而有助于提 dna 產(chǎn)量和改善下游檢測性能。 從 ffpe 中得到的 dna 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 dna 分子量??;dna 降解的程度則取決于樣本類型,儲存時間和固定的條件。
從微量樣本中純化 dna
微量樣本中 dna 的含量很低,通常小于 5 ng dna, 通常需要使用 carrier rna 來提產(chǎn)量(不會影響下游分析檢測)。如果需要使用 carrier rna,那么在測量 od 的時候會因為使用 carrier rna 造成濃度測量有偏差(因為 rna 在 260 nm 也有吸收)。
推薦使用 qiaamp dna micro kit 從微量樣本中進行 dna 純化,該試劑盒采用 minelute 硅膠膜柱,洗脫體積可以低至 20 μl,同時通過兩步洗滌去除 pcr 抑制劑等污染物,大程度從微量樣本中純化 dna。
從血液樣本中純化 dna
血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片,由于血液樣本在采集后會迅速凝固,所以通常在采血時使用 edta,檸檬酸鹽或肝素進行抗凝。經(jīng)過抗凝處理的血液樣本可以直接用于 dna 純化,需要注意的是使用的 dna 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑,以免干擾下游 pcr 檢測。全血也可以在 dna 純化前*行白細胞富集等再進行 dna 純化。
從血液中純化 dna 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細胞數(shù)量,而白細胞數(shù)量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)(如貧血或感染都會造成白細胞數(shù)量變化)。上述情況必須在進行 dna 純化前就應(yīng)該考慮到。此外,有些動物有有核血,這意味著這類樣本中含有更多的 dna,在從此類血樣中純化 dna,上樣量需要減少 10 倍左右。
從細胞中純化 dna
哺乳動物細胞可以使用蛋白酶 k 進行裂解酵母細胞需要先使用*對細胞壁進行處理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 k 進行消化許多**細胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 k 進行裂解,某些**如革蘭氏陽性菌需要預先使用*對細胞壁進行處理**細胞需要先從生物體液中沉淀,然后從中純化** dna,拭子樣本需要先使用**劑進行預處理然后再離心使用機械裂解會比用酶消化的效果要好,尤其是針對革蘭氏陽性菌或**而言
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