elisa試劑盒操作方法、elisa測定出現(xiàn)問題及解決
雙抗體夾心法
1.包被：用0.05mph9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2m硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測od值：在elisa檢測儀上，于450nm(若以abts顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔o(hù)d值，若大于規(guī)定的陰性對照od值的2.1倍，即為陽性。
間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜;
2.次日洗滌3次;
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;
4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌;
6.’最后一遍用ddw洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
elisa測定中可能會出現(xiàn)的問題及可能的原因：
可能的原因(非試劑盒本身的原因)
1.弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問題
2.測定的重復(fù)性差 (相同樣本兩次測定結(jié)果不一致) 這是典型的由測定操作引起的問題，包括
(1)加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致;
(2)加樣過快，孔間發(fā)生污染;
(3)加錯樣本;
(4)加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū);
(5)不同批號試劑盒中組分混用;
(6)溫育時間、洗板、顯色時間不一致;
(7)孔內(nèi)污染雜物;
(8)酶標(biāo)儀濾光片不正確;
(9)血清標(biāo)本未凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等。
3.白板 (陽性對照不顯色)
(1)漏加酶結(jié)合物;
(2)洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈，含酶抑制物(如疊氮鈉)等。
(3)漏加顯色劑a或b;
(4)終止劑當(dāng)顯色劑使用。
4.全部板孔均有顯色
(1)洗板不干凈;
(2)顯色液變質(zhì);
(3)加底物的吸光受酶污染;
(4)洗板液受酶等污染
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