逆轉(zhuǎn)錄（rt）以及隨后進(jìn)行的pcr（rt－pcr）是rna 分析中使用得zui廣泛的技術(shù)之一。如果需要平行分析多個(gè)rna 樣品，方法為一步法rt－pcr。如果要擴(kuò)增困難目標(biāo)片段或從單一cdna 池中擴(kuò)增多重目標(biāo)片段則會(huì)選擇兩步法。eppendorf 推出的全新的cmaster rtpluspcr 系統(tǒng)適用于各種rt－pcr 應(yīng)用。它含有一種全新的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和一種具有高保真性的pcr 酶混合物。另外，rtpluspcr反應(yīng)緩沖液能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無(wú)需優(yōu)化。這種自我調(diào)節(jié)的效果是通過(guò)對(duì)鎂離子的弱螯合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如果鎂離子濃度過(guò)高，螯合劑會(huì)與過(guò)剩的鎂離子結(jié)合，如果反應(yīng)（taq 或dna）需要鎂離子，鎂離子就會(huì)被釋放出來(lái)。這種創(chuàng)新技術(shù)提高了cmaster rtpluspcr的靈敏度和特異性。使cmaster rtpluspcr試劑盒既能進(jìn)行一步法，又能進(jìn)行兩步法rt－pcr，而且具有很大的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，能擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍也很大（一步法反應(yīng)zui長(zhǎng)可擴(kuò)增5.3 kb片段；兩步法方案zui長(zhǎng)能擴(kuò)增12.3 kb 片段）。
下面的實(shí)驗(yàn)可以展示該試劑盒在不同應(yīng)用中的表現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)1關(guān)注新試劑盒在一步法rt－pcr 中的靈敏度。而在一步法應(yīng)用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標(biāo)材料進(jìn)行有效工作。
實(shí)驗(yàn)2顯示應(yīng)用一步法方案進(jìn)行長(zhǎng)距離rt－pcr 不再是個(gè)難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時(shí)保證逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。
本系統(tǒng)提供的兩步法rt－pcr 備選程序適用的模板范圍很廣。實(shí)驗(yàn)3描述了對(duì)不同模板的擴(kuò)增情況。這個(gè)新的系統(tǒng)能為所有的rt目標(biāo)提供全面解決方案，不論需要擴(kuò)增的片段是中等長(zhǎng)度還是極長(zhǎng)，不同來(lái)源的總rna 中轉(zhuǎn)錄本是低豐度還是高豐度。
材料和方法
eppendorf cmaster rtpluspcr系統(tǒng)
eppendorf perfect rna eukaryotic試劑盒
所有的pcr反應(yīng)均在eppendorf mastercycler® gradient梯度pcr儀上進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)1：一步法靈敏度檢測(cè)rt－pcr
擴(kuò)增目標(biāo)：500 bp 的人α微管蛋白mrna 片段。
模板rna：從人hela細(xì)胞中純化的總rna。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：eppendorf cmaster rtpluspcr系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)一步法rt－pcr方案。1:10 稀釋rtpluspcr 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mm，反應(yīng)總體積50μl
循環(huán)參數(shù)：
循環(huán) 步驟 溫度 時(shí)間 描述
1x 1 50°c 30分鐘 逆轉(zhuǎn)錄
1x 2 94°c 3分鐘 初始變性
40x { 3 94°c 15秒 模版變性
4 68°c 45秒 引物退火/延伸
cmaster rtpluspcr 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板rna 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的hela 總rna中檢測(cè)到α微管蛋白mrna。
elisa試劑盒，進(jìn)口elisa試劑盒，elisakit，進(jìn)口血清，進(jìn)口試劑，明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒，大鼠elisa檢測(cè)試劑盒，人elisa檢測(cè)試劑盒-南京信帆生物技術(shù)有限公司