小鼠腸微血管細(xì)胞試劑盒的應(yīng)用！
一、背景
小鼠腸微血管細(xì)胞試劑盒適合于培養(yǎng)小鼠的腸微血管細(xì)胞。
本試劑盒包含：
（1）optitdstm小鼠腸微血管細(xì)胞組織解離液
（2）小鼠腸微血管細(xì)胞組織處理緩沖液
（3）fibrouttm小鼠腸微血管細(xì)胞成纖維抑制劑
（4）小鼠腸微血管組織洗液
（5）小鼠腸微血管細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血清
（6）小鼠腸微血管細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基
（7）小鼠腸微血管組織預(yù)備液。
微血管是指心血管系統(tǒng)的微細(xì)血管，它們?cè)陲@微鏡下才能見(jiàn)到。微血管指通連小動(dòng)脈和小靜脈間的細(xì)小血管，分布于各種組織和器官中，分支通連成網(wǎng)，故也稱終末血管床。小鼠腸微血管細(xì)胞可以保持原代細(xì)胞的分化狀態(tài)，進(jìn)而可以用于評(píng)估體外藥物模型系統(tǒng)和調(diào)節(jié)特定基因的遺傳功能。雖然腸微血管組織機(jī)械韌性很強(qiáng)，但利用小鼠腸微血管細(xì)胞試劑盒中提供的腸微血管組織分離體系來(lái)分離，edta/egta處理過(guò)的腸微血管組織能使得腸微血管組織中微血管細(xì)胞的一些功能特性發(fā)生改變，從而將腸微血管細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。
二、應(yīng)用
用于巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ富蜣D(zhuǎn)染ct-26細(xì)胞對(duì)小鼠原位結(jié)腸癌生長(zhǎng)及微血管生成的影響
巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?mouse macrophage metalloelastase,mme)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmp)家族成員之一,也稱mmp-12。與其它mmp成員不同,mme可以分解纖溶酶原,產(chǎn)生具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),進(jìn)而抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),在抗腫瘤血管生成中具有重要作用。方法pcr擴(kuò)增編碼mme基因結(jié)構(gòu)域ⅰ和ⅱ的cdna片段,克隆入pgem-t載體中,限制性內(nèi)切酶、dna序列分析鑒定目的基因后,定向亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcdna3.1(+)中,并進(jìn)行雙酶切及pcr鑒定。再將構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcdna3.1-mme穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠ct-26結(jié)腸癌細(xì)胞。采用rt-pcr、免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot方法,鑒定mme mrna和重組蛋白在ct-26細(xì)胞中的表達(dá)。
采用體外分解ⅰ型膠原蛋白和明膠酶譜方法,鑒定mme重組蛋白的酶活性。建立mme轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組小鼠原位結(jié)腸癌種植模型,觀察mme對(duì)原發(fā)性結(jié)腸癌生長(zhǎng)的影響,采用免疫組織化學(xué)、原位雜交及western blot方法檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度(microvessel density,mvd)和vegf的表達(dá)。結(jié)果以重組質(zhì)粒puc9-mme cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增,pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后,在1%瓊脂糖凝膠電泳中可見(jiàn)一條清晰的條帶,位于750bp和1000bp之間,與預(yù)期的840bp目的基因片段長(zhǎng)度相符。pgem-t-mme用bamhi和xbai雙酶切,產(chǎn)生2個(gè)大小分別為3.0kb和832bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果基本一致。pgem-t-mme核苷酸序列正向測(cè)序和反向測(cè)序結(jié)果表明,與小鼠mme cdna序列的堿基符合率為99.63%。
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